Víz nukleáz-érzékeny molekuláris biológiai vizsgálatokhoz
A nukleázok kritikus szerepet játszanak számos biológiai folyamatban, és számos sejttípusban megtalálhatók. Ezek az enzimek képesek a nukleinsavak nukleotidjai közötti foszfodiészterkötések hasítására. Ide tartoznak az RNS lebontására specifikus ribonukleázok (RNázok) és a DNS lebontására specifikus dezoxiribonukleázok (DNázok). A nukleázok a nukleinsavakat a szál egyik végpontjáról (exonukleázok) vagy a szál közepéről (endonukleázok) bonthatják. In situ az RNázok idegen nukleinsavakat bontanak, az mRNS lebontásával szabályozzák a génexpressziót, érett RNS-t hoznak létre, és még tumorellenes hatásuk is lehet.
A laboratóriumban a nukleázok problémásak lehetnek, mivel a DNS- és RNS-szálak kisebb fragmentumokra történő hasításával lebonthatják a mintákat, kivonatokat vagy PCR-termékeket. Sajnos mindenütt jelen vannak a laboratóriumban. A baktériumokban például ezen enzimek több osztálya létezik, különböző szelektivitással és aktivitással. Rendkívül aktívak, és csak kis mennyiség elegendő a mintákban jelenlévő nukleinsavak lebontásához.
Miért van szükség a NUCLEASE-FREE WATER-re a molekuláris biológiai kutatásokban?
A mintaveszteség, a reprodukálhatóság hiánya vagy a kísérleti kudarcok elkerülése érdekében fontos, hogy a minták, pufferek, műanyag és üvegedények, padok és minden tárolóedény mindig nukleázmentes legyen. Ezért a nukleázmentes víz (más néven "PCR-víz" vagy "molekuláris biológiai minőségű víz") ajánlott a minták, reagensek és pufferek elkészítéséhez a molekuláris biológiai vizsgálatokhoz és a nukleinsavakkal végzett kísérletekhez.
Hogyan készítsünk nukleázmentes, molekuláris biológiai minőségű vizet
A nukleázmentes, ultratiszta víz a DNS-sel vagy RNS-sel végzett molekuláris biológiai kísérletek - például nukleinsavkivonás, PCR, klónozás, génszerkesztés és szekvenálás - során használt pufferek és reagensek egyik fő összetevője. Többféleképpen is előállítható.
Kémiai kezelés DEPC-vel
Nukleázmentes vizet régóta állítanak elő DEPC (dietil-pirikarbonát) kezeléssel.1 A DEPC reakcióba lép az RNáz aktív helyének hisztidin-maradványainak nitrogénatomjaival, és ezáltal inaktiválja azt. Az inaktiválási lépést követően az oldatot autoklávozzák, hogy a felesleges DEPC-t hidrolízis útján eltávolítsák.
Ez a módszer, bár hatékony és bevált, több hátránya is van:
A kémiai inaktiválás és az autoklávozás lépései egyaránt melléktermékeket, például etanolt és CO2 termelnek, amelyek rontják a vízminőséget. Az etanol szerves szennyeződést (TOC) okoz, és a későbbi kísérleti lépések során nem kívánt melléktermékeket hozhat létre. A CO2 a vízzel reagálva szénsavat és bikarbonátot termel (1. ábra).
ADEPC erős affinitással rendelkezik az adenozinhoz, és az oldatban maradó DEPC-maradványok az adenozin-nukleotidok módosítása révén veszélyeztethetik a kísérleti eredményeket (blotok, PCR-reakciók stb.). Befolyásolhat továbbá néhány downstream enzimatikus reakciót, mivel reagálhat -NH, -SH vagy -OH csoportokkal (pl, Cys, His, Lys, Ser, Thr és Tyr maradékok az aktív központokban).2
Mivel a DEPC nitrogénnel reagál, az amin tartalmú vegyületeken alapuló pufferek, mint például a HEPES és a Tris, nem mehetnek át DEPC kezelésen.
A DEPC-kezelés felvet bizonyos biztonsági aggályokat, mivel könnyen hidrolizálódhat és mérgező. Ezen kívül a reakció és az autoklávozás lépései időigényesek, valamint energiát és vizet igényelnek.
1. ábra. A DEPC lebomlása a víz szennyezéséhez vezet.
Az ultraszűrés hatékonyan biztosít nukleázmentes vizet
A vízben a nukleázok főként baktériumokból származnak. A bakteriális RNázok molekulatömege jelentősen változhat. Például az RNáz I molekulatömege 27 000 Da, míg az RNáz III két 26 500 Da-s alegységből áll.
Az ultraszűrés egy membránalapú technológia, amely a nukleázokat szűrési eljárással távolítja el. Az ultraszűrők olyan mélységi szűrők, amelyek névleges tömeghatárértéke 5 000 Da és 100 000 Da között mozog. Egy gondosan kiválasztott ultraszűrőnek a víztisztítási folyamat felhasználási helyére történő elhelyezésével igény szerint nukleázmentes víz nyerhető (2. ábra). A szállított víz RNázmentes, és nem igényel DEPC-kezelést vagy autoklávozást.
2. ábra. Pásztázó elektronmikroszkópos (SEM) felvétel, amely a Biopak® polírozóban található egyik ultraszűrő poliszulfon üreges szál keresztmetszetét mutatja.
Az ultraszűrés hatékonyságának demonstrálására RNázt adtunk ultratisztaságú vízhez, majd az oldatot egy Biopak® ultraszűrőn keresztül szűrtük. A 3. ábra mutatja az RNáz ultraszűrőbetét általi eltávolításának hatékonyságát. Az ultraszűrés három hónapos időtartam alatt teljesen hatékony volt, és nagy mennyiségű nukleázt tartalmazott.
3. ábra. Az RNáz eltávolításának hatékonysága ultratiszta vízből ultraszűréssel, ultraszűrő patron használatával.
Az ultraszűrés előnyei a DEPC-kezeléssel szemben
Az ultraszűrés a DEPC-kezelés alternatívája a víztisztító rendszerből származó RNázmentes, ultratiszta víz előállítására. A DEPC-kezeléssel szemben számos előnnyel jár:
Kényelem és gyorsaság: A nukleázmentes vizet igény szerint az ultraszűrőbetéttel felszerelt víztisztító rendszer szolgáltatja.
Fenntarthatóság: A nukleázmentes víz előállítása in-situ történik; nincs szükség kémiai kezelésre, autoklávozásra vagy palackos szállításra.
Vízminőség: A nukleázmentes víz frissen tisztított és azonnal felhasználható. Ráadásul, mivel nem használunk kémiai adalékanyagot, a víz minősége megmarad.
Biztonság: Nem használunk mérgező vegyszereket.
Laborvízmegoldások molekuláris biológiai kutatásokhoz
A frissen tisztított, ultratiszta víz, amelyet az adagolás helyén ultraszűréssel szűrtek, olyan vizsgálatokhoz ajánlott, amelyek nukleázmentes vizet igényelnek. A Milli-Q® ultratisztaságú víztisztító rendszerek felszerelhetők egy Biopak® felhasználási helyhez tartozó ultraszűrővel, amelyhez egy minőségi tanúsítványt mellékelnek, amely 90 napig garantálja az RNáz-, DNáz- és baktériummentes vizet.
Laborvíz megoldások támogatása
Ha támogatást szeretne a laboratóriuma és alkalmazásai számára optimális víztisztítási megoldás meghatározásához, kérjük, töltse ki és küldje el az alábbi űrlapot. Kérjük, adja meg érdeklődését, hogy az Ön igényeihez igazíthassuk nyomon követésünket. A csillaggal jelölt mezők kitöltése kötelező.
Hivatkozások
Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.
Még nem rendelkezik fiókkal?