DNS oligonukleotid szintézis

A 80-as években kifejlesztett, majd később szilárd fázisú hordozókkal és automatizálással továbbfejlesztett foszforamidit-kémia a DNS-oligonukleotidok gyártásának választott módszere. A bioszintézissel ellentétben a kémiai szintézis a 3' → 5' irányban halad a 1. ábra-ban vázolt lépések szerint. Megjegyzés: ez a cikk kizárólag a DNS-szintézisre összpontosít (bár hasonló, vannak különbségek az RNS kémiai szintéziséhez képest). 

Bővebben

• Oligonukleotid-szintézis foszforamidit módszer
• a href="#cleavage">Cleavage
• Deprotekció
• A hozam

1. ábra. A szilárd fázisú oligonukleotidszintézis ciklusának összefoglalása. Az 1. lépésben, a detritilálásban az 5'-DMT védőcsoportot eltávolítjuk az első, szilárd hordozóval összekapcsolt nukleozidról. A 2. lépésben, a csatolásban az első, szilárd hordozóval összekapcsolt nukleozid szabad 5'-OH-ja megtámadja a beérkező második nukleozid foszforját, kiszorítva annak diizopropilaminocsoportját. A 3. lépésben, az oxidációban az instabil foszfit-triészter stabil foszfát-triészterré alakul át, ami lehetővé teszi a következő ciklus folytatását az 1. lépésben, a második nukleotid detritilálásához. Mielőtt azonban a következő ciklusra lépnénk, a 4. lépésben, a fedésnél a szilárd hordozóhoz kötött, nem reagált 5'-OH-val rendelkező nukleozidokat acetilálják, ezáltal megakadályozva a deléciós mutációkkal rendelkező szekvenciák megnyúlását (a fedést az oxidáció után végzik, hogy minden vizet kiszorítsanak, amely egyébként gátolná a reakció következő ciklusát).

Oligonukleotid szintézis foszforamidit módszer

Ez a szakasz a foszforamidit módszer négy lépésének [1. lépés (detritilálás), 2. lépés (kapcsolás), 3. lépés (fedés) és 4. lépés (oxidáció)] részletes kémiai folyamatát vizsgálja.

1. lépés (detritilálás)

A ciklust a szilárd hordozóval összekapcsolt nukleozid (az oligonukleotid terminális 3' bázisát tartalmazza) 5'-DMT (4,4'-dimetoxitritil) védőcsoportjának eltávolításával indítjuk el. Az 5'-DMT megakadályozza a nukleozid polimerizációját a szilárd hordozógyanta funkcionalizálása során. A mechanizmust a 2. ábra mutatja be.

2. ábra. A detritilációs mechanizmus. Az 5'-DMT védőcsoportot TCA (triklórecetsav) segítségével távolítják el diklórmetán oldószerben (a TCA túl koncentrált oldata vagy a túl hosszú detritilálási idő depurinációhoz vezet, és így csökkenti a végső oligonukleotid teljes hozamát). A termékek közé tartozik a 3'-terminális nukleozid egy szabad 5'-OH-val és egy DMT-karbokációval (az elektron delokalizáció által kialakított rezonancia szerkezet nem látható). A nukleozid továbbhalad a szintézis 2. lépéséhez, míg a DMT-karbokáció 495 nm-en abszorbeál, és ezáltal narancssárga színt eredményez, amely a csatolás hatékonyságának ellenőrzésére használható.

2. lépés (Kapcsolódás)

Amint a DMT-t eltávolítottuk, a szilárd hordozóval összekapcsolt nukleozid szabad 5'-OH-ja képes reagálni a következő nukleoziddal, amelyet foszforamidit-monomerként adunk hozzá. A mechanizmus a 3. ábrán látható.

3. ábra. A kapcsolási mechanizmus. A beérkező foszforamidit-monomer diizopropilaminocsoportját az oldószerben, acetonitrilben az ETT [5-(etil-tio)-1H-tetrazol] savas katalizátor "aktiválja" (protonálja). A keverés a szintetizáló eszköz folyadékvezetékeiben történik, miközben a reagenseket a szilárd hordozóra juttatják. Az aktivált foszforamiditot sokszoros feleslegben adagoljuk a szilárd hordozóhoz kötött nukleozidhoz képest, hogy a reakciót a lehető legközelebb vigyük a befejezéshez. A termékek között foszfit-triészter kötéssel és szabad diizopropil-aminocsoporttal rendelkező dinukleozidok találhatók.

3. lépés (Oxidáció)

A kapcsolási reakció során képződött foszfit-triészter természetellenes és instabil, ezért a következő ciklus megkezdése előtt stabilabb foszforfajjá kell alakítani. Az oxidáció a foszfit-triésztert stabil foszfát-triészterré alakítja át. A mechanizmus a 4. ábrán látható.

4. ábra. Az oxidációs mechanizmus. A foszfit-triészter oxidációja jóddal történik víz és piridin jelenlétében. A termék a foszfát-triészter, amely lényegében egy standard DNS-gerinc, a szabad oxigénen β-cianometil védőcsoporttal.

4. lépés (fedés)

Mivel a 100%-os kapcsolási hatékonyság lehetetlen, mindig van néhány szilárd hordozóval összekapcsolt nukleozid, amelynek 5'-OH-ja nem reagált. Ha nem blokkoljuk, ezek a hidroxilcsoportok a következő ciklus során reakcióba lépnek, és így egy hiányzó bázist eredményeznek. Ezeknek a deléciós mutációknak az egymást követő ciklusok során történő felhalmozódása olyan "shortmers" összetett keverékét hozná létre, amelyet nehéz tisztítani, és ezért az oligonukleotidot a későbbi alkalmazás során használhatatlanná teheti. A shortmerek felhalmozódásának megakadályozásához sapkázásra van szükség. A mechanizmust az 5. ábra mutatja be.

Az 5. ábra.

5. ábra. A fedezeti mechanizmus. Az ecetsav-anhidrid és az N-metillimidazol reakciója során egy köztitermék keletkezik a kis mennyiségű piridint tartalmazó tetrahidrofurán oldószerben. A keverés a szintetizáló eszköz folyadékvezetékeiben történik, miközben a reagenseket a szilárd hordozóra juttatják. A termék a szilárd hordozóval összekapcsolt nukleozid acetilált 5'-OH-val (a piridin fenntartja a bázikus pH-t, ezáltal megakadályozza a foszforamidit-monomer szabad acetát/ecetsav általi detritilálását).

Az egymást követő ciklusok

A második ciklus az 1. lépéssel, a detritilációval kezdődik, majd ezt követi a fennmaradó három lépés mindegyike. Az ismételt ciklusok száma megegyezik a kívánt bázisok számával. Az oligonukleotidokat 2-től 120 bázisig szintetizáljuk.

Cleavage

A szabadalmaztatott szilárd hordozónk/linkerünk stabil minden foszforamidit-reagenssel szemben, de a szintézis végén leválasztható az oligonukleotidról. A hasításra azért van szükség, hogy a szabad 3'-OH részt vehessen a biokémiai reakciókban, például a DNS-polimeráz általi hosszabbításban a PCR során, amikor az oligonukleotid primerként szolgál. A reaktáns és a termék a 6. ábrán látható.

6. ábra. A hasadás reaktánsa és terméke. A kötőanyag észter-hidrolízise (és a szilárd hordozó egyidejű eltávolítása) tömény vizes ammóniával történő kezeléssel történik. A termék az oligonukleotid egy terminális, szabad 3'-OH-val.

Védőanyag-mentesítés

A hasítást követően az oligonukleotid koncentrált vizes ammóniában lévő oldatát felmelegítjük, hogy eltávolítsuk a védőcsoportokat a bázisokról és a foszfátokról.

Bázisok

Míg a timinnek nincs szüksége védőcsoportra, addig az adeninnek, citozinnak és guaninnak igen, mivel exociklikus primer aminocsoportokat tartalmaznak. A védőcsoportokat el kell távolítani, hogy az oligonukleotid és a célnukleinsav között megfelelő hidrogénkötések alakulhassanak ki. A reaktáns és a termék a 7. ábrán látható.

7. ábra. A bázisos leválasztás reaktánsa és terméke. Az oligonukleotidot koncentrált vizes ammóniában felmelegítjük. A védőcsoportok közé tartoznak: A, N(4)-benzoil C és N(2)-izobutiril G. A reakció terméke a teljesen védett A, C és G bázisok.

A standard védőcsoportok mellett a labilis dimetilformamidil G és az "ultramild" védőcsoportok is használhatók az ammóniára érzékeny módosított oligonukleotidok esetében. Ezeket a védőcsoportokat a megfelelő bázisokon a 8. ábra mutatja be.

8. ábra. Labilis és ultramild védőcsoportok. A dimetil-formamidil védőcsoportot jellemzően koncentrált vizes ammóniában hevítéssel, de lényegesen rövidebb idő alatt távolítják el, mint az izbutiril-csoportot. Az ultramild védőcsoportok közé tartoznak: Ezeket általában szobahőmérsékleten, koncentrált vizes ammónia/metilamin oldatban távolítják el.

Foszfodiészter-képződés

A foszfát szabad oxigénjén lévő β-cianoetilcsoportot el kell távolítani ahhoz, hogy foszfát-triészterből foszfát-diészterré (foszfodiészterré) alakuljon át. A mechanizmust a 9. ábra mutatja.

9. ábra. A foszfodiészter-képződés mechanizmusa a védőtlenítésen keresztül. A cianoetilcsoportokat koncentrált vizes ammóniában β-eliminációval távolítjuk el. A reakció gyors, mivel az elektronelvonó cianocsoport melletti szénatomok hidrogénatomjai erősen savasak. A termékek a natív foszfodiészter gerinccel rendelkező oligonukleotid és az akrilnitril.

A hozam

A szintézis hozama nagymértékben függ a kapcsolási hatékonyságtól. Még 99,5%-os hatékonyság mellett is, amit könnyen elérünk, az 1. táblázatban látható, hogy az oligonukleotid hosszának növekedésével a hozam gyorsan csökken.

1. táblázat. Hozam, hossz és kapcsolási hatásfok A hosszonkénti hozam a kapcsolási hatásfok segítségével határozható meg a képlet segítségével: (Y = hozam; CE = kapcsolási hatékonyság; és N = oligonukleotid hossza)]. Még 99,5%-os kapcsolási hatékonyság esetén is a gyakorlati szintézis hosszhatára általában 120 bázis, hogy 50%-os hozamot érjünk el.

Hosszúság (bázisok)	Kapcsolási hatékonyság
	90.00%	95.00%	97.00%	98.50%	99.50%
10	34.90%	59.90%	73.70%	86.00%	95.10%
20	12.20%	35.80%	54.40%	73.90%	90.50%
50	0.52%	7.70%	21.80%	47.00%	77.80%
100	0%	0.59%	4.80%	22.10%	60.60%
150	0%	0%	1.00%	10.40%	47.10%
200	0%	0%	0%	0.23%	4.90%	36.70%

Nem szabad megfeledkezni arról, hogy nem csak a kapcsolási hatékonyság határozza meg a hozamot. A deprotekció, a hasítás és a tisztítás (még az egyszerű sótalanítás is) tovább csökkenti a hozamot. A gyártási skálán és tisztításon alapuló garantált hozamaink itt találhatók.

.