Genomi DNS-tisztítás és értékelés
A DNS és RNS tisztítására szolgáló egyszerű módszerek elérhetősége nagyban megkönnyítette a genom és a génexpresszió elemzését és jellemzését. A DNS és RNS gyors és kényelmes izolálására van igény a legkülönbözőbb sejtforrásokból, beleértve az emlősökből, növényekből és baktériumtenyészetekből származó sejteket és szöveteket. A DNS-izolálás és -tisztítás hagyományos megközelítései többlépcsős eljárásokon alapulnak, amelyek fenol/klórform, anioncserélő vagy szilikagél csererendszereket foglalnak magukban. Az RNS tisztítása általában kaotróp sót és fenol/klórformot tartalmaz, további oligo-dT tisztítási lépéssel, ha mRNS-re van szükség.
A PCR- vagy RT-reakcióba bevitt templátanyag minősége nagyban befolyásolja a kapott adatok megbízhatóságát1. Kritikus fontosságú a célanyag minőségének meghatározása és jelentése2 és előnyös a lehető legjobb minőségű nukleinsav használata. Ez a fejezet mélyrehatóan elemzi a targetminőség hatását a kapott qPCR és RT-qPCR adatokra, figyelembe véve mind a tisztaságot, mind az integritást.
Nukleinsav-tisztítás
A legtöbb molekuláris biológiát alkalmazó kísérlet első követelménye a nukleinsav-tisztítás. A DNS- és RNS-mintákat gyakran "nyers" preparátumokkal nyerik. Ezek a tisztítási módszerek gyorsak és közvetlenek lehetnek, és különösen hasznosak, ha a mintákat PCR/RT-PCR-ben használják fel, ahol csak kis mennyiségű DNS-re vagy RNS-re van szükség. Egyes alkalmazásokhoz hagyományos módszerekkel tisztított mintára van szükség; a végső alkalmazás határozza meg a legmegfelelőbb módszer kiválasztását. Ha a biológiai anyagból származó nukleinsavnak épnek, tisztának, koncentráltnak és a későbbi enzimatikus reakciók gátlói nélkülinek kell lennie, az extrakciós eljárásokhoz kaotrofikus szerek hozzáadására van szükség.
Chaotropic Agents
A chaotropic agent olyan anyag, amely a molekula háromdimenziós szerkezetének megbontásával denaturálja a fehérjéket, a DNS-t vagy az RNS-t. Az ilyen anyagokat a molekula háromdimenziós szerkezetének megbontásával denaturálja. A káotróp szerek beavatkoznak a stabilizáló molekulán belüli kölcsönhatásokba, amelyeket nem kovalens erők, például hidrogénkötések, van der Waals-erők és hidrofób hatások közvetítenek. A leggyakrabban használt kaotróp szerek közé tartozik a karbamid (6-8 M), a guanidin HCL (6 M) és a lítium-perklorát (4,5 M). A guanidin-tiocianát egy erős fehérje denaturálószer, amely erősebb, mint a guanidin HCl, és gyakran használják az ép ribonukleinsav izolálása során az RNáz-aktivitás megszüntetésére. Számos RNS-izolálási protokoll tartalmaz merkaptoetanol hozzáadását a káotróp mellett, hogy redukáló környezetet biztosítson, amely denaturálja a ribonukleáz A (RNáz A) nyolc ciszteinmaradványa között kialakuló négy diszulfidhidat. A kaotróp szer és egy redukáló szer, például a merkaptoetanol kombinációja a ribonukleáz kibontakozását és aktivitásának teljes elvesztését okozza.
A genomi DNS extrakciója
A nyers előkészítés
Az Extract-N-Amp™. készletek segítségével gyorsan és hatékonyan, szinte bármilyen mintatípusból kivonható PCR-képes genomi DNS (gDNS) egy egyszerű, egycsöves protokoll segítségével, amely a mintától függően 15 percet vagy kevesebbet vesz igénybe. Az Extract-N-Amp Kitek segítségével gDNS-t nyertek ki olyan mintákból, mint a teljes vér, szőrtüszők, egérfarokcsipeszek, szövetkultúrasejtek, bukkális tamponsejtek, Drosophila melanogaster, különböző növények és magvak. A teljes tisztítási eljárásokkal ellentétben ez a megközelítés elkerüli a mechanikai bontást, a szerves extrakciót, az oszlopos tisztítást vagy a DNS kicsapását. A készletek tartalmaznak reagenseket a DNS extrahálásához és amplifikálásához, amely számos későbbi alkalmazásban felhasználható, beleértve a PCR/qPCR elemzést is.
Genomi DNS tisztítása
A DNS szinte bármilyen sejt- vagy szöveti forrásból izolálható. A gDNS tisztítása megköveteli a sejtből való eltávolítását, miközben meg kell védeni a lebomlástól. Az izolálási eljárásoknak elég kíméletesnek kell lenniük ahhoz is, hogy a hosszú DNS-szálakat megvédjék a mechanikai stressztől. A mintát először egy pufferben, például foszfát pufferelt sóoldatban (PBS) gyűjtik, amely általában detergens, például Triton™ X-100 vagy nátrium-dodecil-szulfát (SDS) tartalmú, a sejtek líziséhez és a fehérjék és lipidek szolubilizálásához. Proteináz K-t adunk az összecsomósodott sejtek és szövetek szétválasztásához és az enzimek proteolitikus emésztéssel történő inaktiválásához. Az etiléndiamintetraecetsav (EDTA) egy kelátor, amely az oldatban lévő fémionok elnyelőjeként működik, és a DNS-tisztító pufferekhez adják a magnéziumionok (Mg2+) eltávolítására. A Mg2+ a DNázok nélkülözhetetlen kofaktora, ezért a Mg2+ eltávolítása inaktiválja a DNázokat, megakadályozva a DNS lebontását. A sejtekben jelen lévő RNS lebontása érdekében gyakran RNáz is szerepel.
A sejtek lizálása és az RNS, a fehérjék és a lipidek lebontása után a DNS-t el kell választani ezen anyagok megmaradt maradványaitól. A klasszikus tisztítási módszerek fenol/kloroform3 -t használnak a fehérjék eltávolítására, így a DNS és más vízben oldódó anyagok maradnak vissza. A TRI Reagent® ennek a módszernek az adaptációját használja. Alternatív megoldásként olyan rendszerek használatával, mint a GenElute™ gDNS-tisztító készletek, a DNS-t szilika alapú membránokra adszorbeálják (egyoszlopos és 96 lyukú formátumban), a fehérjék szerkezetét megbontó kaotróp sók jelenlétében. Növényi anyagból történő DNS-tisztításkor a szövetet először mechanikusan, folyékony nitrogénben történő őrléssel kell megbontani, míg a teljes vért vagy baktériumokat enzimekkel előinkubáljuk a hatékony sejtlízis és DNS-felszabadítás biztosítása érdekében. A DNS-t a membránokhoz kötődve mossuk, majd a sókoncentráció változtatásával eluáljuk, és ezt követően detergenssel és kaotróp hatóanyaggal szabadítjuk fel. A fehérjéket, poliszacharidokat és sejttörmeléket kicsapási eljárással távolítjuk el, amelyet szűrőoszlopon keresztül történő centrifugálás követ.
Teljes RNS tisztítása
A sejtek RNS-ének tisztítása szükséges a génexpresszió vagy más, RNS által szabályozott sejtfunkciók vizsgálatához. A teljes RNS a sejtes DNS-ből (gDNS és mitokondriális DNS, mtDNS) átírt RNS, és általában olyan mintára utal, amely tartalmazza: Riboszomális, transzfer- és hírvivő RNS-t (rRNS, tRNS és mRNS), és nem tartalmazza a mikroRNS-t (miRNS) vagy a kisebb nem kódoló RNS-t (ncRNS). A teljes RNS az a frakció, amelyet a génexpressziós elemzéshez izolálunk.
Az RNS izolálása kihívást jelent, mivel a sejtekben és szövetekben mindenütt jelen vannak ribonukleáz enzimek (RNázok), amelyek az RNS-t gyorsan lebontják. Ezért a tisztítási folyamat során RNáz-inhibitorokat alkalmaznak. A tisztítás leggyakoribb módszere a guanidinium-tiocianát-fenol/klórform extrakció. Ezen az elven alapul a TRI Reagent®, amely egy monofázisú, fenolt és guanidin-tiocianátot tartalmazó oldat. A szövet- vagy sejtmintát a TRI Reagensben homogenizáljuk vagy felbontjuk, a lizátumhoz kloroformot keverünk, majd az elegyet centrifugálással három fázisra választjuk szét. Az RNS-t tartalmazó vizes fázist eltávolítjuk, és az RNS-t izopropanollal kicsapjuk. A GenElute RNS izoláló készletek a sejtlízist követően szilikagyantára rögzítik az RNS-t. A GenElute kitek guanidin-tiocianátot és 2-merkaptoetanolt használnak az RNázok inaktiválására a teljes nukleáris és citoplazmatikus RNS izolálásakor. Guanidin-tiocianát jelenlétében a fehérjék könnyen feloldódnak, a sejtstruktúrák szétesnek, és a nukleoproteinek a fehérjék másodlagos szerkezetének elvesztésével disszociálnak a nukleinsavaktól. Továbbá, mivel a guanidin-tiocianát erősebb, mint a guanidin HCL, az RNázok tartósan denaturálódnak. A lizátumokat egy szűrőoszlopon átpörgetjük a sejttörmelék és a nyírási DNS eltávolítása érdekében. A szűrletet ezután egy nagy kapacitású szilícium-dioxid oszlopra juttatjuk a teljes RNS megkötésére, majd mosás és elúció következik RNázmentes vízzel vagy pufferrel.
A teljes RNS-mintából a legtöbbet az rRNS teszi ki (~80%), míg az mRNS frakció mindössze 2-5%-ot. Egyes eljárásoknál kívánatos lehet az mRNS tisztítása a jóval nagyobb mennyiségben előforduló rRNS és tRNS közül. A GenElute mRNS Kitek kényelmes eljárásokat biztosítanak a poliadenilált mRNS izolálásához korábban elkészített teljes RNS-ből vagy közvetlenül emlős sejtekből és szövetekből. A közvetlen mRNS-előkészítéshez a sejteket vagy szöveteket SDS/proteináz K emésztéssel bontjuk fel az RNS felszabadítása és az RNázok eltávolítása érdekében. Ezután 1 μm-es polisztirol gyöngyökhöz kovalensen kapcsolt Oligo dT30 -t használnak a poliadenilált mRNS hibridizációval történő befogására. A polisztirol gyöngyök a hibridizáció során szuszpendálva maradnak, így nincs szükség keverésre vagy ringatásra. Az mRNS-gyöngy komplexeket mikrocentrifuga spin szűrőn mossuk, majd a tisztított mRNS-t eluáljuk.
A "teljes RNS" tisztítására használt extrakciós módszerek közül sokan specifikusan a nagyobb molekulákat választják ki, így nem alkalmasak a kisebb ncRNS-ek, köztük a miRNS-ek izolálására. Léteznek kifejezetten a kisebb RNS-fajok frakcióinak tisztítására kifejlesztett készletek, amelyeket akkor lehet kiválasztani, ha ezek az érdeklődésre számot tartó templát jelentik.
Mikro-RNS (miRNS) és nem kódoló RNS (ncRNS)
A miRNS és más, kisebb ncRNS-molekulák tisztítása nagyobb kihívást jelent rövid hosszúságuk miatt. Fontos, hogy olyan megfelelő RNS-izolálási módszert válasszunk, amely megtartja a kis RNS-t, és kerüljük a teljes RNS-tisztító kitek használatát, kivéve, ha a gyártó kifejezetten azt állítja, hogy a teljes RNS tartalmazza a kis RNS <100 bázisú RNS-eket. Az ncRNS extrakciós módszerei az RNS-molekulák és bármely más szennyező tényező közötti különbségeket célozzák meg, specifikus oszlopkötés vagy kicsapás alkalmazásával. Az RNAzol® egy savas guanidin-tiocianát-fenol keverék, amely megbontja a sejteket és szöveteket, és kloroform vagy bróm-klór-propan hozzáadásával elválasztja az összes RNS-fajt a fehérjéktől és a DNS-től. A tisztítási módszerek ezután lehetővé teszik a kis RNS-, mRNS- vagy teljes RNS-minták külön-külön történő előállítását, így e frakciók mindegyike párhuzamosan elemezhető a downstream alkalmazásokban. A miRPremier® microRNS izoláló készletek szilika alapú, kötőszálas mosó-öblítéses készletek, amelyeket kifejezetten kis RNS kinyerésére terveztek. A miRPremier kit a kis RNS oszlophoz való kötése előtt a nagyobb molekulák eltávolítására sóoldó megközelítést alkalmaz, mivel a kis RNS szilícium-dioxidhoz (szilícium-dioxidhoz) való kötéséhez szükséges etanol mennyisége a fehérjéket és más makromolekulákat is kicsapja, viszkózus szuszpenziót hozva létre, amely eltömítheti az oszlopokat és megakadályozhatja az RNS hatékony kinyerését. Egy alternatív megközelítés e probléma megkerülésére a makromolekulák eltávolítására szolgáló előzetes tisztítási lépés alkalmazása, például RNAzollal vagy egy előkötőoszloppal történő extrakcióval, így elegendő alkohol adható a kis RNS megkötéséhez anélkül, hogy az RNS-kötőoszlop eltömődne.
Nukleinsavminta minőségének értékelése
A minták kezelése és a nukleinsav extrakciós eljárások változóak, ezért kritikus fontosságú, hogy megbízható protokollt határozzunk meg a minta minőségének és mennyiségének elemzésére, és hogy a publikációkba2 belefoglaljuk ennek az elemzésnek a részleteit. Az RNS mennyiségét nagyrészt az rRNS hozama határozza meg, míg az RNS minőségét a tisztaság (inhibitorok hiánya) és az RNS-molekulák integritása. A minta minőségének mérésekor azonban a tisztaság és az integritás befolyásolja az eredményeket; egy alacsony koncentrációjú minta tisztaságát és integritását nehéz meghatározni, és a szennyeződések jelenléte zavarhatja a mennyiségi meghatározást. A nukleinsavak mennyiségének és minőségének értékelésére számos technika használható, de ezek egyike sem nyújt önmagában minden olyan információt, amely a minta teljes leírásához szükséges. Ezért fontos, hogy a lehetőségek összességét mérlegeljük annak biztosítása érdekében, hogy a minta minősége ne befolyásolja a végső elemzési adatokat1.
Nukleinsav-kvantitatív meghatározás
UV spektroszkópia
A nukleinsavakat hagyományosan az UV-abszorpció spektrofotométerrel történő mérésével határozzák meg. A hígított DNS- vagy RNS-minta abszorbanciáját 260 nm-en és 280 nm-en olvassák le. A 260 nm-en mért optikai sűrűséget (OD) az oldatban lévő RNS vagy DNS koncentrációjának meghatározására használják a Beer-Lambert-törvény segítségével, amely lineáris összefüggést jelez előre az abszorbancia és a koncentráció között.
Beer-Lambert-törvény
A = εbc
A = abszorbancia
b = a küvetta úthossza cm-ben (jellemzően 1 cm)
c = analit koncentrációja
ε = extinkciós együttható
RNS esetén ε = 40 μg/ml
DNS esetén ε = 50 μg/ml
Az OD 260 nm-en (A260) 1.0 körülbelül 40 μg/ml tiszta RNS-nek és 50 μg/ml tiszta kettős szálú DNS-nek felel meg. A Beer-Lambert-törvény azonban csak 2-ig terjedő OD-értékekre érvényes, és a megadott OD/koncentráció összefüggés a minták tisztaságától függ. Nyilvánvaló, hogy a 260 nm-en vagy 280 nm-en abszorbeáló szennyező anyagok befolyásolják a becsült OD-értéket. A tiszta RNS A260/A280 értéke 2,1, míg a tiszta DNS A260/A280 értéke 1,8.
A potenciálisan szennyező anyagok, mint például a fehérjék, kaotróf sók és fenol OD-je is meghatározható, ha a minta abszorbanciáját 280 nm-en és 230 nm-en (A280 illetve A230, -en) mérjük. Ily módon az A260/A280 és az A260/A230 aránya a minta tisztaságának indikátoraként használható. Meg kell azonban jegyezni, hogy a DNS-ben lévő fehérjekontamináció meghatározása nagyon érzéketlen e megközelítés4 alkalmazásakor.
Kiegészítésképpen a pH és a puffer ionerőssége is zavarja az OD-leolvasást. Kimutatták, hogy az A260/A280 arány jelentős változékonyságot mutat, ha a spektrofotometriás meghatározásokhoz különböző vízforrásokat használnak. Például az RNS szuszpendálásához használt víz pH-értékének 5,4 és 7,5-8,5 közötti változása jelentősen megnövelte az RNS A260/A280 arányt, körülbelül 1,5 és 2,05 között.
Fontos, hogy mind az A260/A280 arány, mind az A260/A230 arány közel 2,0 (7.1. táblázat).
TRIS, etanol és izopropanol szennyezés
A TRIS-szennyezés hatása: A TRIS-szennyezés nem befolyásolja jelentősen az RNS/DNS abszorbancia spektrumát.
Az etanolszennyezés hatása: Az etanol nincs jelentős hatással az RNS/ DNS abszorbancia spektrumára, ha TE pH 8,0-ban mérjük. Ha azonban a mérést tiszta vízben végezzük, az A260/A280 arány csökkenhet, így a 2,0-nál alacsonyabb arány etanolszennyeződésre utalhat.
Izopropanolszennyezés hatása: Az izopropanolnak nincs jelentős hatása az RNS/DNS abszorbancia spektrumára, ha TE pH 8,0-ban mérjük. Ha azonban a mérést tiszta vízben végezzük, az A260/A280 arány csökkenhet, így a 2,0-nál alacsonyabb arány izopropanol-szennyeződésre utalhat.
Protein-, guanidin-izotiocianát- és fenolszennyeződés
A fehérjeszennyeződés hatása: Egy olyan minta, amely 0.01% BSA-t tartalmazó minta szinte normális abszorbancia spektrumot mutathat, bár az A260/A280 arány 1,9 (RNS) vagy 1,7 (DNS) alá csökkenhet, ami figyelmeztető jel arra, hogy valami szennyezi a mintát. 0,5% BSA esetén az abszorbancia spektrumok rendellenesnek tűnnek, és ez egyértelműen jelzi, hogy a mintában jelentős mértékű szennyeződés van. Ezért a nagy fehérjekoncentráció kimutatható a rendellenes A260/A280 arányok alapján, de az alacsony és mérsékelt mennyiségek nem.
A guanidin-izotiocianát szennyezés hatása: A guanidin-izotiocianát kevéssé befolyásolja az A260/A280 arányt, ezért a guanidin-izotiocianátnak csekély hatása van az RNS mennyiségi meghatározására. A guanidin-izotiocianát jelenléte azonban nagyon erős hatással van az A260/A230 arányra; 0,5%-os szennyezettségnél az A260/A230 arány 0,5 alá csökken. A guanidin-szennyezés gyanúját tartalmazó mintákat kerülni kell, mivel ez káros hatással van a későbbi enzimatikus reakciókra.
A fenolszennyezés hatása: A fenol nagyon erős hatással van az RNS mennyiségi meghatározására. Egy 50 ng/μl-es RNS-minta 0,5%-os fenolszennyezése esetén a mért koncentráció több mint háromszorosára nő. A fenolnak ez az erős zavaró hatása az RNS mennyiségi meghatározására a 270 nm-nél lévő szennyező abszorpciós csúcsnak köszönhető. Nagyon alacsony, 10 ng/μl alatti RNS-koncentrációknál ez a szennyező csúcs gyakran összetéveszthető az RNS-sel. Az RNS abszorbancia azonban mindig 260 nm-nél van, és soha nem 270 nm-nél, ezért ha a csúcs 270 nm-nél van, az szennyeződésnek tudható be. Miután az RNS-t fenolos módszerrel izolálták, az RNS-koncentráció téves túlbecslése komoly problémát jelent. Ez különösen akkor fordul elő, ha az RNS alacsony koncentrációjú.
Automatizált UV spektrofotometria
Míg a hagyományos UV-spektrofotometriánál a méréseket viszonylag nagy mennyiségű minta felhasználásával kellett elvégezni, ma már léteznek olyan rendszerek, mint a NanoDrop® 2000 UV-Vis spektrofotométer, amelyek automatizáltak, és rendkívül kis mintaméretek rendkívül pontos elemzését támogatják. A mintatartó rendszerek kiküszöbölik a küvetták és kapillárisok szükségességét, ami az elemzett minta mennyiségét 0,5 μL és 2 μL közé csökkenti. A NanoDrop körülbelül 200 nm és 350 nm között pásztázza az abszorbanciát, ami az RNS/DNS-koncentráció és tisztaság meghatározásához releváns tartomány.
Fluoreszcencia alapú nukleinsav-kvantitatív rendszerek
A fluoreszcens festékek használata a nukleinsavak mennyiségi meghatározására az abszorbancia spektrofotometria6,7 alternatívája. A nukleinsav-koncentráció fluoreszcens módszerekkel történő meghatározása kis molekulák vagy festékek nukleinsavakhoz való kötődését használja, és az ezt követő fluoreszcenciajellemzők változását méri. Bár drágább, mint az abszorbancia-spektrofotometria, a fluoreszcencia-alapú mennyiségi meghatározás érzékenyebb, pontosabb és specifikusabb lehet az adott nukleinsavra.
A fluorométerek a fluoreszcenciát nem abszolút, hanem relatív egységekben mérik, ezért a mérést először a mérendő mintához hasonló jellemzőkkel rendelkező standard nukleinsavoldat ismert koncentrációjával kalibrálják. A kalibrálást követően egyetlen méréssel megállapítható az oldatban lévő nukleinsav koncentrációja, de jellemzően standard görbére van szükség a vizsgálat linearitásának megállapításához a mért tartományban.
Automatizált rendszerek, mint például a QuBit® 2.0 fluorométer (Life Technologies), számos különböző fluoreszcencia alapú mennyiségi meghatározó teszttel használhatóak az oldatban lévő nukleinsav-koncentráció mérésére. A próbák széles dinamikai tartományt mutatnak a detektáláshoz, és képesek kis minták pontos elemzésére.
Kritikus megfigyelni, hogy az OD-érték az abszorpció mérése, és nem használható a minta minőségének teljes körű értékelésére. Hasonlóképpen a fluoreszcens alapú rendszerek a mennyiséget és nem a minőséget mérik. Ezek például nem használhatók a minta integritásának vizsgálatára, és megfelelő analízist is el kell végezni, például kapilláris elektroforézist, gélfelbontást vagy a 3'/5' arány vizsgálatot (az alábbiakban leírtak szerint).
Gélelektroforézis és kapilláris nukleinsav-minőségelemző rendszerek
.Gélelektroforézis
Az RNS, bár termodinamikailag stabil, a szinte mindenütt jelen lévő RNáz enzimek jelenlétében gyorsan emésztődik. Ennek eredményeként a mintában általában rövidebb RNS-fragmentumok fordulnak elő, amelyek potenciálisan veszélyeztethetik a későbbi alkalmazások eredményeit. Az RNS lebontási folyamata csak részben ismert, és a jelen lévő RNáz típusától függ. Az adott extrakcióból származó RNS minősége is nagymértékben változhat, ezért folyamatos felügyeletet igényel. Ezért fontos az RNS-minták integritásának meghatározása.
A potenciális degradáció értékelésére olyan elektroforetikus módszereket alkalmaztak, amelyek a mintákat a tartalmazott molekulák mérete szerint választják szét. Történelmileg az RNS integritását etídium-bromiddal festett agarózgél-elektroforézissel értékelték, amely meghatározott sávos mintázatot eredményez. A denaturáló agarózgélen futtatott teljes RNS két különböző riboszómális fragmentumot mutat, amelyek eukarióta RNS esetén a 18S vagy 28S, illetve prokarióta RNS esetén a 16S és 23S, valamint további kisebb RNS-fajok fragmentumait. Hagyományosan ezen rRNS-sávok intenzitását a denaturáló agarózgélen egy olyan arányszám kiszámítására használták, amely az RNS integritásának jelzésére szolgált. Az RNS akkor tekinthető jó minőségűnek, ha az eukarióta 28S:18S sávok intenzitásának aránya körülbelül 2,0.
Az 1. ábra egy példát mutat a teljes RNS etídium-bromiddal festett agaróz gélelektroforézissel történő értékelésére. Jó minőségű teljes RNS esetén a két legnagyobb rRNS körülbelül 5 kb és 2 kb sávban diszkrét sávként jelenik meg, és a felső sávnak körülbelül kétszer olyan intenzitásúnak kell lennie, mint az alsónak. Az mRNS világos kenetként jelenhet meg, vagy alig látható, többnyire a két rRNS-sáv között.
1. ábra.Az RNS integritásának értékelése agarózgél-elemzéssel. A teljes RNS-mintákat (2 μg) 1%-os agaróz gélen frakcionáltuk TBE pufferben, és etídium-bromiddal festettük. Az 1. és 2. sávban a jó minőségű RNS, míg a 3. és 4. sávban a lebomlott RNS látható.
A gélelektroforézis azonban érzéketlen módszer a minta integritásának meghatározására, és nagy mintakoncentrációt igényel. Ha kis mintákkal dolgozunk, ritkán áll rendelkezésre elegendő mennyiség a gélelektroforézis lefuttatásához és az összes kívánt kísérlet elvégzéséhez is. Mivel ez a megközelítés a gélképek emberi értelmezésére támaszkodik, szubjektív, nehezen összehasonlítható egyik laboratóriumról a másikra, és a kapott adatok nem dolgozhatók fel digitálisan.
Ezek közül néhány problémára megoldást jelent a teljes RNS automatizált kapilláris elektroforézissel történő elemzése.
Kapilláris nukleinsav-minőségelemző rendszerek
A nukleinsavminták elemzése és összehasonlítása olyan műszerekkel végezhető, mint az Agilent 2100 BioAnalyzer vagy a Bio-Rad Experion. E rendszerek segítségével az elektroforetikus nyomok segítségével numerikus integritási értékeket vagy integritási kategóriákat rendelnek hozzá.
Ezek a műszerek egy lab-on-a-chip megközelítést alkalmaznak, amely a kapilláris elektroforézist fluoreszcens detektálással kombinálja. A chipen végrehajtott elektroforézis a hagyományos gélelektroforézis elvein alapul, amelyeket miniatürizáltak, ami csökkenti a mintafogyasztást és az elválasztási időt.
A chipen a minták, a gél és egy külső standard (fragmensméret létra) számára kialakított mélyedések találhatók. A gyártás során mikrocsatornákat gyártanak üvegből, hogy a kutak között összekapcsolt hálózatokat hozzanak létre. Ezeket a mikrocsatornákat ezután szitáló polimerrel és fluoreszcens festékkel töltik fel. A lyukakba elektródákat helyeznek, és a chip integrált elektromos áramkörré válik.
A feltöltött biomolekulákat, például DNS-t vagy RNS-t feszültséggradiens hatására a mátrixon keresztül hajtják. Az állandó tömeg-töltés aránynak és a szitáló polimer mátrix jelenlétének köszönhetően a molekulák méret szerint szétválnak, így a kisebb fragmentumok gyorsabban vándorolnak, mint a nagyobbak.
A festékmolekulák interkalálódnak a nukleinsav szálakba, és ezeket a komplexeket lézer indukálta fluoreszcenciával detektálják. Az adatokat ezután elektronikus gélszerű képekké és elektropherogramokká alakítják át.
Az Agilent 2100 BioAnalyzer az RNA 6000 Nano és az RNA 6000 Pico LabChip kitekkel együtt használható. Ez a bioanalitikai eszköz a mikrofluidikus chipek, a géllel töltött csatornákban feszültség által indukált méretszeparáció és a lézer-indukált fluoreszcencia (LIF) detektálás kombinációján alapul miniatürizált méretben. Tizenkét minta feldolgozható egymás után, miközben minden egyes mintából nagyon kis mennyiséget fogyaszt. Az RNS-molekulákat interkaláló festékkel festik meg és LIF segítségével detektálják. Az adatok automatikusan archiválódnak, és elektropherogram, gélszerű kép és táblázatos formátumban állnak rendelkezésre.
A BioAnalyzer jó lineáris dinamikai tartományt biztosít, és az RNA 6000 Nano assay 25 ng/μl és 500 ng/μl közötti koncentrációjú RNS-minták elemzésére használható. Bár az RNA 6000 Nano assay alsó mennyiségi határértékeként 25 ng/μL van megadva, az RNS integritási szám (RIN) értelmes kiszámításához legalább 50 ng/μL ajánlott. Alacsonyabb koncentrációk használata esetén a RIN értékek nagyobb mintánkénti eltérései figyelhetők meg. A Pico assay használható az RNS integritásának meghatározására 50 pg/μL és 5 ng/μL közötti koncentrációjú minták esetében.
Az Agilent 2100 BioAnalyzer szoftver segítségével értékelhető az rRNS-csúcsok előtt, között és után kimutatott RNS aránya az RNS-mintára vonatkozó relatív integritási szám (RIN) meghatározása érdekében. Az intakt RNS 10-es RIN-számmal rendelkezik, míg a teljesen lebomlott RNS 1-es RIN-számmal. Így megkönnyíti az elektroferogram értelmezését és lehetővé teszi a minták összehasonlítását.
A részben lebomlott RNS (RIN <9) kielégítő eredményeket adhat az RT-qPCR-ben, de ez valószínűleg az elemzett célpontoktól, a szükséges érzékenység mértékétől és az RT-stratégiától függ. Az olyan RT-qPCR-stratégia, amely két lépésben oligo-dT-t használ a reverz transzkripció indításához és PCR-primereket a hosszú cDNS 5'-végéhez közel, sokkal nagyobb integritású mintákat igényel, mint az olyan stratégia, amely egylépéses RT-qPCR-t használ génspecifikus primerekkel. A különböző RT-stratégiák hatását és a lebomlott sablonokkal szembeni toleranciájukat részletesen tárgyaljuk (lásd Reverse Transcription). Ezenkívül nagyobb mintaintegritásra lesz szükség ahhoz, hogy egy ritka, nem pedig egy bőséges mRNS-célpontot detektáljunk. Ezért figyelembe kell venni a templát lebomlásának hatását a különböző gyakoriságú célpontok (pl. teszt- és referenciagének) arányára is. A RIN és az RT-qPCR sikeressége közötti korrelációt minden egyes vizsgálat esetében empirikusan kell meghatározni. Bár a RIN óriási mértékben megkönnyíti az RNS-készítmények integritásának értékelését, és nagyban megkönnyíti a minták vagy az RNS-izolálási eljárások összehasonlítását, még nem lehet előre meghatározni, hogy az RNS alkalmas lehet-e egy adott kísérlethez. A 2. ábra két RNS-mintára vonatkozóan mutatja az Agilent BioAnalyzer nyomvonalát. Az egylépéses RT-qPCR-rel, génspecifikus primerekkel előállított cDNS-ben több ritka mRNS-célpont hozamában nem észleltünk különbséget. Azonban ugyanazok az mRNS-célpontok akár 2 ciklussal később is kimutathatók voltak, ami 4-szer kevesebb mRNS-t jelzett, az alacsonyabb integritású mintában (11, RIN = 7,0), mint a jobb minőségű mintában (9, RIN = 9,8), amikor kétlépéses RT-qPCR-t alkalmaztunk, oligo-dT-vel az RT alapozásához.
2. ábraAz RNS integritásának értékelését bemutató elektroferogram az Agilent 2100 BioAnalyzer segítségével. A teljes RNS-készítményekből származó mintákat (~150 ng) RNA 6000 Nanochipen frakcionáltuk és az Agilent 2100-as készülékkel felbontottuk. Az integritást értékeltük és RIN-értéket adtunk
A minták minősége kritikus, ezért a minták qPCR-próbákban való felhasználása előtt ellenőrizni kell. Egyértelműen bebizonyosodott, hogy a lebomlott RNS-minták elemzése rossz minőségű adatokat eredményezhet1, bár ez nem mindig van így8 és részben az RT protokolltól függ (Reverse Transcription)9.
Bár a kapilláris rendszerek nagy előrelépést jelentenek a hagyományos gélelektroforézishez képest, ezek speciális berendezések, drágák és nem alkalmasak nagy áteresztőképességre. Ezenkívül megfigyelték, hogy a RIN nem biztos, hogy az a csodaszer mérés, amire vágynánk. A 3. ábra olyan mintákat mutat, amelyeket csupasz emberi bőrön 1 percig inkubáltak, és váratlanul látszólag nem mutattak degradációt, amikor a teljes RNS-t Agilent BioAnalyzerrel elemezték. A degradáció meghatározására szolgáló alternatív módszerrel ezekről is kiderült, hogy degradált transzkripteket tartalmaznak (lásd alább).
3. ábra.A teljes RNS (~150 ng) elektroszkópos diagramja, amelyet kapilláris elektroforézissel oldottak fel Agilent 2100 BioAnalyzerrel. Az RNS-t az elemzés előtt 1 percig inkubáltuk egy meztelen emberi kézen. Az elemzés 10-es RIN értéke azt jelezte, hogy az RNS nyilvánvalóan jó minőségű és ép volt.
Ezért fontos, hogy óvatosan értelmezzük a RIN és más, automatikusan generált mintaintegritás mérőszámokat, és fontoljuk meg egy további, transzkriptspecifikus vizsgálat elvégzését. Az egyik ilyen megközelítés egy célpont két független vizsgálattal történő mérésére épül. Az integritásvizsgálat az ugyanazon transzkript 5' és 3' irányában elhelyezkedő célpont mennyiségének arányát méri (4. ábra)10. Ez a transzkriptspecifikus RNS integritásának relatív mértékét adja (a 3'/5' assay protokollját lásd Appendix A).
).
4. ábra.A 3'/5' integritási vizsgálatot bemutató ábra. cDNS-t teljes RNS-ből állítottunk elő oligodT primed RT segítségével. Két qPCR próbát tervezünk ugyanarra a transzkriptre, és a szondákat különböző fluorofórral jelöljük a multiplex kimutatás megkönnyítése érdekében. Ha az RNS intakt, az 5' és a 3' próbák detektálásának egyenlőnek kell lennie, míg ha az RNS degradálódik, akkor a 3' próba detektálása nagyobb mértékű lesz az 5' próba detektálásához képest.
A 3'/5'-arányt így az RNS-minták minőségének értékelésére használják. Ennek a megközelítésnek a használatát az 5. ábra mutatja be, a 3. ábrán bemutatott RNS-mintában a GAPDH-transzkript állapotának vizsgálatával (a vizsgálandó konkrét célpontokat minden egyes kísérletben vizsgálni kell). Az oligo-dT alapozású cDNS-szintézist követően a GAPDH-transzkriptumot 5' és 3' próbával is számszerűsítjük. Ha az RNS intakt, akkor mindkét próbával azonos koncentráció várható (arány = 1), míg ha az RNS degradálódott, akkor a 3'-próbával magasabb kópiaszám várható az 5'-próbához képest.
5. ábra. A 3'/5'-próba demonstrálása degradált RNS-minták azonosítására. Bár az Agilent 2100 BioAnalyzer analízis mindkét RNS-mintára 10-es RIN-t adott vissza, a 3'/5' assay segítségével 9 Cq (kb. 1000-szeres) veszteséget mutattunk ki az 5' assay-ben az emberi kézen történő 1 perces inkubációt követően (1' degradáció), míg a 3' változatlan maradt.
Az RNS Agilent 2100 BioAnalyzer segítségével végzett elemzése arra a következtetésre vezetett, hogy a 3. ábra -ban látható RNS sértetlen volt, 10-es RIN-t regisztrálva mind az RNS esetében a meztelen emberi kézen történő 1' inkubáció után, mind pedig ugyanezen tisztított minta esetében a lebontás előtt. A 3'/5' assay alkalmazásakor a 3' assay mindkét minta esetében ugyanazt a Cq -t mutatta, míg az 5' assay 9 ciklusnyi veszteséget mutatott, ami a GAPDH 5' 1000-szeres veszteségét és a transzkript lebomlását jelzi. Ez a megfigyelés alátámasztja annak bizonyítását, hogy az rRNS állapota (a RIN-algoritmus jelentős összetevője) nem megbízható mutatója az mRNS integritásának. A 3'/5' vizsgálat megbízhatósága azonban, mint a minta általános minőségének mérőszáma, attól függ, hogy az egyes transzkriptumok milyen sebességgel degradálódnak11. Ennek vizsgálatára a HT29 sejtekből kivont RNS-t 72 órás szobahőmérsékleten, vagy alternatívaként 2 órás 62 °C-on történő inkubálással degradációnak vetettük alá. Minden minta minőségét Agilent 2100 BioAnalyzerrel elemeztük. A próbákat 13 ubiquitikusan expresszálódó gén 3' és 5' régiójára is terveztük, és e célpontok mennyiségét a tisztított, jó minőségű, nem lebomlott RNS-mintában (HT29) mindkét próba segítségével határoztuk meg minden gén esetében (6A ábra).
6A. ábra.RNS-minőség meghatározása 3'/5' Assay segítségével a) A HT29 sejtekből származó, körülbelül 10-es RIN értékű RNS-mintákat oligo-dT segítségével reverz transzkripcióval írtuk át, és a 3'/5' arányt (y tengely) mind a 13 génre (X tengely) meghatároztuk. A mennyiségi meghatározásban általános 3' torzítás tapasztalható, ha mindkét próbát ugyanarra a célpontra alkalmazzák, és az RNS jó minőségű. A torzítás mértéke génenként eltérő, így befolyásolja a gének közötti arányok meghatározását, például egy referenciagénre való normalizáláskor. (Az adatokat Prof. Stephen Bustin, Egyesült Királyság, szíves hozzájárulásával bocsátotta rendelkezésünkre).
6B. ábra.A HT29 sejtekből származó, körülbelül 7-es RIN értékű RNS-mintákat oligo-dT segítségével reverz transzkripcióval írtuk át, és a 3'/5' arányt (y tengely) mind a 13 génre (X tengely) meghatároztuk. Erős 3' torzítás tapasztalható a számszerűsítésben, ha mindkét vizsgálatot ugyanarra a célpontra alkalmazzák, és az RNS jó minőségű, valamint a 7.6A. ábrán bemutatott arányhoz képest egyértelmű 3' eltolódás tapasztalható. Az eltolódás mértéke jelentősen eltér a gének között, ami azt jelzi, hogy a különböző gének különböző sebességgel degradálódnak. (Az adatokat Prof. Stephen Bustin, Egyesült Királyság, szíves hozzájárulásával bocsátotta rendelkezésünkre.)
6C. ábra.A HT29 sejtekből származó, körülbelül 5 RIN értékű RNS-mintákat oligo-dT segítségével reverz transzkripcióval írtuk át, és a 3'/5' arányt (y tengely) mind a 13 génre (X tengely) meghatároztuk. A replikátumok adatai között nagy a szórás. (Az adatokat Prof. Stephen Bustin, Egyesült Királyság, szíves hozzájárulásával bocsátotta rendelkezésre).
A jó minőségű RNS használata esetén a replikátumok adatai nagyon közel állnak egymáshoz, de egyértelmű, hogy sok gén esetében a vizsgálatban akár 10-szeres torzítás is előfordul, általában a 3' irányába, az UBC esetében pedig még drámaibb, 100-szoros torzítás figyelhető meg. Ez tükrözheti a degradációt vagy az assay-k eltérő detektálását a templát hajtogatása vagy más, az RT-PCR-t befolyásoló tényező miatt. Úgy tűnik, hogy néhány céltárgy 5' irányú eltérést mutat a detektálásban, ami a vizsgálat hatékonyságának különbségéből vagy az RT-qPCR vizsgálat egyéb összetevőiből adódhat. Az assay-ket ezután ugyanezen célpontok mennyiségi meghatározására használtuk 7,3 és 5,3 RIN értékű RNS-ből származó cDNS felhasználásával (6B és 6C ábra). A mérsékelten degradált (RIN 7) RNS-minták használata esetén egyértelmű jelei voltak a degradációnak, a legtöbb génnél 10 és 1000-szeres közötti 3' eltolódást mutattak, ami ezen transzkriptek degradációját jelzi a 3' és 5' vizsgálatok között. Érdekes módon három gén 5' eltolódást mutatott, ami azt jelezheti, hogy a degradáció konformációváltozást eredményezett, ami hatékonyabbá tette az RT vagy az 5' qPCR-t. Mivel az egyes gének esetében a változások eltérőek, egyértelmű, hogy a RIN 9 RNS használatával mért génarány jelentősen eltérne a RIN 7 RNS használatával mért aránytól. Az RIN 5 RNS használata esetén nagyobb a variabilitás mértéke, és az egyes gének 3'/5' aránya átlagosan 1 körül van. Mivel a 3'/5' =1 átlaga a jó minőségű intakt RNS esetében is elvárható lenne, felismerhető, hogy ez a rendszer alkalmazható a mérsékelten vagy látszólag nem degradált RNS-minták integritásának meghatározására, és a gél- vagy kapilláris elektroforézis mellett használva előrelépést jelent.
Az 5' torzítás megfigyelése a vizsgálatokban érdekes volt. Elméletileg azonos hatékonyságú próbák esetén nem lenne lehetséges, hogy több 5' mint 3' amplikon keletkezzen. Nyilvánvaló, hogy további tényezők befolyásolják e próbák eltérő teljesítményét. A minta minőségének további szempontja a szennyező anyagok jelenléte, amelyek gátolhatják vagy akár fokozhatják az RT vagy a qPCR teljesítményét, és hogy ezek lehetnek-e genetikai célpont-specifikusak.
Contamination
A PCR-mérések kontextusában a kontamináció jelentős formái a mintában nem megfelelő módon jelen lévő nukleinsav-templátumok, amelyek a specifikus célpont mellett is detektálhatók, és hamis pozitív eredményt eredményezhetnek, vagy olyan anyagok, amelyek gátolhatják a downstream reakciókat, hamis negatív eredményt vagy a templátkoncentráció alacsonyabb becslését okozva.
Mintaszennyeződés
A PCR-mérések különösen érzékenyek a specifikus célszekvenciával való amplikonszennyeződésre, mivel a PCR folyamata exponenciálisan generálja az amplikon másolatait. Következésképpen a PCR-vizsgálat elvégzésének folyamata tökéletes kontaminánst termel a későbbi PCR-vizsgálatokhoz. Egy molekuláris biológiai laboratóriumban elengedhetetlen, hogy a reakció beállításának és lefuttatásának helyét elkülönítsük a PCR utáni elemzési területtől, ahol a PCR-terméket elemezni és tovább manipulálni fogják. Amennyiben lehetséges, célszerű külön helyiségeket használni, külön berendezésekkel és laboratóriumi köpenyekkel, hogy a PCR utáni elemzési térből semmi ne érintkezzen a tiszta (PCR előtti) térrel. Sok laboratórium további ellenőrzéseket is bevezet a személyzet e területekre való bejutására, hogy megakadályozza a reakciók átvitelét. A kvantitatív PCR-mérések különösen érzékenyek az amplikonszennyeződésre, mivel egyetlen templátmolekulát képesek kimutatni, és a szennyező templát megzavarja a mennyiségi méréseket.
A specifikus amplikon PCR-generálásán túlmenően a laboratóriumi berendezésben gondosságra van szükség annak biztosítására, hogy az eredeti templátanyag ne kerüljön át egyik mintából a másikba (keresztkontamináció), vagy - emberi minták elemzése esetén - hogy az elemzést végző személyzetből ne kerüljön be anyag.
A potenciális szennyeződési források azonosítása érdekében erősen ajánlott egy standard kísérleti eljárás elfogadása megfelelő kontrollokkal.
Az RNS gDNS-szel való szennyeződése
Az RNS elemzésekor fontos biztosítani, hogy ne legyen gDNS-szennyeződés. A minták enzimatikus kezelése DNáz I oldattal ajánlott a szennyező gDNS eltávolítására, és különösen fontos az intron nélküli gének vizsgálatánál, vagy amikor a vizsgálat tervezése nem tesz különbséget a gDNS és a cDNS szekvenciák között. Ahol csak lehetséges, célszerű az intron/exon határon túlra tervezni a vizsgálatokat úgy, hogy csak a feldolgozott mRNS-szekvenciák legyenek amplifikálhatók és/vagy detektálhatók. Ez nem mindig akadályozza meg a gDNS-ből történő amplifikációt, mivel vannak olyan szekvenciák, amelyek feldolgozott pszeudogénekként léteznek, amelyek gyakorlatilag genomiális cDNS-szekvenciák (lásd PCR/qPCR/dPCR Assay Design). Azt is érdemes figyelembe venni, hogy a reagensekben DNS is létezik, és potenciálisan szennyezési problémákat okozhat12.
.Gátlás
Az inhibitorok jelenléte differenciáltan befolyásolja a különböző célpontokra13 irányuló qPCR-méréseket. Ezért az inhibitorok jelenléte egy mintában a valódi adatok összetett torzulását eredményezheti. Mivel minden egyes próbára másképp hat, a kapott arányok az érdeklődésre számot tartó gén (GOI) és a referencia gén mennyiségek között nem feltétlenül tükrözik az egyes gének valódi mennyiségét, ami a relatív célpont mennyiségek helytelen becsléséhez vagy a genotipizáló próbák értelmezésének nehézségeihez vezet.
A kísérleti folyamatok során gyakran bevezetett PCR-inhibitorok közé tartoznak: trisz, etanol, izopropanol, EDTA, a reverz transzkriptáz enzim, guanidin-izotiocianát és fenol.
Az inhibitorok kimutatására használható egyik rendszer a SPUD assay14 (7. ábra). Ezzel a módszerrel egy mesterséges amplikont (amely egy olyan burgonya nukleinsav szekvenciából származik, amelynek nincs homológiája más ismert szekvenciával) qPCR-nek vetünk alá víz (amplifikációs kontroll; 7. ábra a minta) vagy a vizsgálati minta (7. ábra b és c minta) jelenlétében. Ha a vizsgálati minta nem tartalmazza a SPUD-próbát gátló anyagot, akkor az amplifikációs kontroll és a vizsgálati minta esetében rögzített mennyiségi meghatározási ciklus (Cq) azonos lesz. Ha azonban a vizsgálati minta inhibitort tartalmaz, a Cq megnövekszik (a vizsgálat részletes protokollját a SPUD protokoll, Appendix A).
7.7. ábra.A SPUD-teszt ábrázolása. Ebben az esetben a c minta és az a kontrollminta közötti Cq különbség az inhibitor jelenlétét mutatja.
Egy integrált példa:
A korábban ismertetett mintaminőség-ellenőrzési módszerek mindegyike a minta egy adott tulajdonságának meghatározására szolgál. Ez a szakasz egy példamunkafolyamat leírását tartalmazza, amely a mintákra alkalmazható, az egyes minőségellenőrzési tesztek által szolgáltatott adatok leírásával. A bemutatott vizsgálat nem kimerítő, és nem is végleges szabványműveleti eljárásként szerepel, csupán egy lehetséges minőségellenőrzési eljárás példájaként szolgál.
Öt RNS-mintát készítettünk, amelyeket egymás után A-tól E-ig jelölünk. Ezeket a NanoDrop segítségével elemeztük, és nagyon hasonló koncentrációjúnak találtuk (100 ng/μL körül). Az A260/A280 arányt kétszer vettük fel két független leolvasás segítségével minden egyes minta esetében (8. ábra), és azt találtuk, hogy megközelítőleg 1 volt.9 minden esetben, ami arra utal, hogy a minták jó minőségűek és szennyező anyagoktól mentesek, mint ahogyan az A280 nm-en kimutatható lenne, figyelemre méltó, hogy az A230 nm-es leolvasás hiányzik ebből az elemzésből. A kapilláris elektroforézissel (Agilent 2100 BioAnalyzer) végzett elemzés más képet mutat (9. ábra). Az A és B minta kiváló minőségű (RIN 10 és 110 ng/μL koncentráció, ami megegyezik a NanoDrop leolvasásával), a C minta erősen degradált (RIN 2,4, 62 ng/μL koncentráció, ami a NanoDrop koncentráció-meghatározásának fele), a D és E minta pedig kiváló minőségű (RIN 9,1 és 9,5), de alacsonyabb koncentrációjú, mint az A és B minta (30 ng/μL és 43 ng/μL). A két mérési módszerből származó információk némileg kiegészítik egymást, mivel a NanoDrop nem mutatja ki a lebomlást. Ugyanakkor ellentmondásban is áll, mert a D és E minták koncentrációja jelentősen eltér egymástól. Ez aggodalomra adna okot, és további vizsgálatokat kellene indítania. Bár a kapilláris elektroforézis hatékony eszköz a minták értékeléséhez, viszonylag alacsony az áteresztőképessége, és nem minden kutató számára elérhető. A minta integritásának alternatív tesztje a 3'/5' analízis. Ezt a tesztet az A-E mintákra alkalmaztuk, a NanoDrop leolvasás szerint azonos koncentrációkat használva. Amikor ezeket a mintákat ezzel a módszerrel vizsgáltuk, egyértelmű volt, hogy az A minta (10A ábra) és a B minta (adatok nem láthatóak, azonos az A mintával) RNS-e ép volt, míg a C minta RNS-e erősen degradálódott (10B ábra). Megjegyzendő, hogy a C minta Cq értéke mind az 5', mind a 3' próbák esetében jelentősen eltolódott a magasabb értékek felé, ami a specifikus célpont elvesztését mutatja az A és B mintához képest. A D és E minták profilja nem felelt meg a várakozásoknak (a 10C ábra a D mintát mutatja, az E minta adatai nem láthatóak, de hasonlóak voltak), mivel az 5' vizsgálat alacsonyabb Cq -t mutat, mint a 3', ami több 5' jelet jelez, mint 3' az oligo-dT primerrel előállított cDNS-mintában. Az alternatív magyarázat az, hogy ezek a minták olyan inhibitort tartalmaznak, amely a 3' assay-t jobban befolyásolja, mint az 5'-t. Ennek az elméletnek a tesztelésére a SPUD-tesztet az összes mintán lefuttattuk (11. ábra). Az A-C mintákban nincs nyoma inhibitornak, de a D és E minták mindkettőben gátlást mutatnak a SPUD-próbára, a D minta pedig teljesen meghiúsítja a próbát.
Az összes információt felhasználva arra lehet következtetni, hogy minden mintában azonos koncentrációjú nukleinsavanyag volt (NanoDrop), és a minták nem kimutatható szennyező anyagokat tartalmaztak, amelyek 280 nm-en (fehérje) elnyelődnek (más hullámhosszakat nem vizsgáltunk). Az A és B minta magas integritású volt, detektált inhibitorok nélkül, a C minta erősen degradált (kapilláris elektroforézis és 3'/5' assay), detektált inhibitorok nélkül, a D és E minta pedig ép volt, de tartalmazott PCR-inhibitorokat (3'/5' és SPUD).
8. ábra.NanoDrop minőségértékelés (A260/A280).
9. ábra.Agilent 2100 BioAnalyzer RNS-minták elemzése A-E.
10A. ábra.GAPDH 3'/5' Multiplex Assay RNS minta.
10B. ábra.GAPDH 3'/5' multiplex analízis minta C.
10C. ábra.GAPDH 3'/5' Multiplex Assay minta D.
11. ábra.Az A-E minták SPUD-elemzése.
Hivatkozások
Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.
Még nem rendelkezik fiókkal?