Sejtszámlálás hemocitométerrel

A legtöbb manipulációhoz a sejtvonalak, például transzfekciók, sejtfúziós technikák, kriokonzerválás és szubkultúrás rutinok esetében szükséges a sejtek számának számszerűsítése a felhasználás előtt. Az egyenletes sejtszám használata fenntartja az optimális növekedést, és segít a sejtkultúrákat használó eljárások standardizálásában is. Ez pedig jobb reprodukálhatóságú eredményeket biztosít.

Bővebben

• Anyagok
• Felszerelés
• eljárás
• Főbb pontok

Materials

• Cell culture media: a megfelelő hőmérsékletre előmelegítve (a megfelelő médiumot és hőmérsékletet lásd az ECACC sejtvonal adatlapján.)
• 70%-os (v/v) alkohol steril vízben (793213)
• /li>
• Trypan kék oldat (T8154)
• 0.05%-os tripszin/EDTA HBSS-ben, Ca²⁺/Mg²⁺ nélkül (T3924)

Készülékek

• Egyéni védőfelszerelés (steril kesztyű, laboratóriumi köpeny, védőszemüveg)
• Vízfürdő megfelelő hőmérsékletre állítva
• Mikrobiológiai biztonsági szekrény a megfelelő elszigeteltségi szinten
• li>Centrifuga
• CO₂ inkubátor
• Hemocitométer
• Fáziskontrasztmikroszkóp
• Előre felcímkézett lombikok

Eljárás

1. A tapadó és félig tapadó sejteket a korábban leírtak szerint tripszin/EDTA segítségével szuszpendáljuk szuszpenzióba, és reszuszpendáljuk a tripszin mennyiségével legalább egyenértékű mennyiségű friss tápfolyadékban. A csomókban növő sejtek esetében centrifugáljon és reszuszpendáljon kis térfogatban, majd óvatosan pipettázzon a csomók felbontásához.
2. Szteril körülmények között távolítson el 100-200 μl sejtszuszpenziót.
3. Adjunk hozzá ugyanekkora mennyiségű Trypan Blue-t (hígítási tényező =2), és óvatos pipettázással keverjük össze.
4. Tisztítsuk meg a hemocitométert.
5. Nedvesítsük meg a fedőlapot vízzel vagy kilélegzett levegővel. Csúsztassa a fedőlapot a kamra fölött előre-hátra, enyhe nyomással, amíg a Newton-törésgyűrűk meg nem jelennek (a Newton-törésgyűrűk szivárványszerű gyűrűknek látszanak a fedőlap alatt).
6. Töltse meg a kamra mindkét oldalát sejtszuszpenzióval (kb. 5-10 μL), és nézze meg inverz fáziskontrasztmikroszkóp alatt x20-as nagyítással.
7. Számolja meg az életképes (fényes sejtekként látható) és a nem életképes (kékre festett) sejtek számát. Ideális esetben >100 sejtet kell megszámolni a sejtszám pontosságának növelése érdekében (lásd az alábbi megjegyzéseket). Jegyezze fel a megszámlált négyzetek számát, hogy megkapja a >100-as számot.
8. Az alábbi egyenletek segítségével számítsa ki az életképes és a nem életképes sejtek koncentrációját és az életképes sejtek százalékos arányát.

1. ábra. Formulák az életképes sejtek számának, a nem életképes sejtek számának és a sejtek milliliterenkénti százalékos életképességének kiszámításához.

Főbb pontok

1. A Trypan Blue mérgező és potenciálisan rákkeltő. Védőruházatot, kesztyűt és arc/szemvédelmet kell viselni. Ne lélegezze be a gőzt.

2. A számláló kamra központi területe 1 mm². Ez a terület 25 kisebb négyzetre van felosztva (1/25 mm²). Ezek mindegyikét hármas vonalak veszik körül, majd tovább osztják 16-ra (1/400 mm²). A kamra mélysége 0,1 mm.

3. A 10⁴ korrekciós tényező 0⁴ -t konvertál.1 mm³ -t 1 ml-re (0,1 mm³ = 1 mm² x 0,1 mm)

4. A pontatlanságnak több forrása is van:

•  A légbuborékok és törmelék jelenléte a kamrában
• A kamra túltöltése, úgy, hogy a minta a csatornákba vagy a másik kamrába folyik
/li>
•  A kamra nem teljes feltöltése A sejtek nem egyenletesen oszlanak el a kamrában
•  Túl kevés sejt a számoláshoz. Ezt a sejtek centrifugálásával, kisebb térfogatban történő újbóli szuszpendálásával és újraszámlálással lehet kiküszöbölni
•  Túl sok sejt a megszámláláshoz. Ezt úgy lehet kiküszöbölni, hogy a trypan-kékben nagyobb hígítási tényezőt használunk, pl. 1:10

5. A hemocitométer használata időigényes lehet, érzékeny a kezelő szubjektív megítélésére, és egyes sejttípusokat, például a klasztereket alkotó sejteket különösen nehéz megszámolni ezzel a módszerrel. Kaphatók sejtszámláló berendezések, amelyek alternatív sejtkvantitatív módszereket kínálnak, beleértve a Scepter™ Cell Counter. A Muse^® Cell Analyzer lehetővé teszi a sejtek számának és életképességének áramlási citometrián alapuló értékelését. A Scepter™ Cell Counter egy hordozható, kézben tartható sejtszámláló, amely a Coulter-elv alapján méri a térfogatot. Képes a sejtek méret szerinti számszerűsítésére, és megkülönbözteti a nagyobb sejteket a kisebb törmelékektől, ellentétben a látásalapú technikákkal, amelyek objektumfelismerő szoftverre támaszkodnak, és nem képesek megbízhatóan felismerni a kis sejteket. A Scepter™ sejtszámláló minden sejtet érzékel, és a populációt a sejtméret-eloszlás hisztogramjaként jeleníti meg. A hisztogramból megszámolhatja az összes sejtet, vagy a gating funkció segítségével megszámolhat egy kiválasztott alpopulációt. A hisztogram változásainak nyomon követésével betekintést nyerhet a sejtkultúra egészségébe és minőségébe egyik kísérletről a másikra.

2. ábra. Sejtek számolása hemocitométer és trypan-kék segítségével. Az életképes sejtek ép sejtmembránnal rendelkeznek, és nem veszik fel a trypan-kéket, ezért a hemocitométeren világosnak/világosnak tűnnek. Az elhalt sejtek sejtmembránja sérült, és felveszik a trypan-kéket, így a hemocitométerben kéken jelennek meg. A sejtek életképességét az élő/halott sejtek arányának meghatározásával lehet megbecsülni.