Sejtkultúra-szennyezés hibaelhárítás

Áttekintés
Szennyeződések típusai

A szennyeződések gyakori okai és megelőzése
    Mikrobiális (baktériumok, gombák, élesztőgombák)
    Mycoplasma
    Vírusfertőzés
     Kémiai szennyeződés
Általános tippek és technikák
   A biológiai biztonsági szekrényben való munkavégzés
    Aeroszolok felszívása és megelőzése
    Determinálás/a>
    Az egészséges sejtek rutinszerű ellenőrzésének elvégzése

Kultúraszennyezés: Bár a "sejtkultúra-szennyezés" tipikusan a sejtek között lévő baktériumokra és a zavaros közegre gondol, a kultúrlombikban lévő nem kívánt betolakodók sokféle formát ölthetnek. A vírusos és kémiai szennyeződések is jelentős következményekkel járhatnak a kultúra egészségére nézve, és annak biztosítása, hogy a sejtvonalak ne legyenek keresztszennyeződve, kritikus fontosságú az eredmények reprodukálhatósága szempontjából.

Mennyire elterjedt a sejtkontamináció? Az FDA, az ATCC és mások tanulmányai alapján becslések szerint napjainkban az összes sejttenyészet 5-30%-a csak mycoplasma fajokkal szennyezett. Egy tanulmányban⁵ szerint a gyakori sejtvonalak vírusfertőzöttségének előfordulása meghaladta a 25%-ot, és a nem citopátiás vírusok még a mikoplazmáknál is nagyobb valószínűséggel kerülik el a kimutatásukat, mivel a tenyészetek egészségi állapota nem adhat támpontot jelenlétükre.

1. ábra. Sejtek szennyeződése

Egy adott szennyezőanyag ellenőrzésének kulcsa néha azzal függ össze, hogy milyen könnyen kimutatható. A bakteriális, gombás és élesztős szennyeződések gyakran szabad szemmel is láthatóak, és gyorsan elpusztíthatják a tenyészetben lévő sejteket, de a finom morfológia miatt a jelentős mikrobiális betolakodókat, például a mikoplazmát nehezebb lehet azonosítani. Ehhez képest a vírusokat hagyományos fénymikroszkópiával egyáltalán nem lehet kimutatni, ezért felfedezésükhöz gyakran a sejtek megmagyarázhatatlan leválásának vagy a sejtek rossz egészségi állapotának más jeleinek vagy akár a sejtpusztulásnak a megfigyelései vezetnek.

Az utóbbi években a biológus közösséget érintő egyik legjelentősebb aggodalom a kutatói sejtvonalak szennyeződése vagy akár egyenesen téves azonosítása. Erről a fontos témáról bővebben klikk ide, hogy megértse a keresztszennyezett sejtvonalak okait és előfordulását, valamint azt, hogyan értékelhető a sejtvonal-azonosság integritása.

A kultúraszennyezés típusai

Baktériumok, gombák, élesztők:
Mikrobiális szennyeződések

A bakteriális, gombás (beleértve a penészgombákat is) és élesztőgombás szennyeződések szabad szemmel általában a táptalaj gyorsan fellépő zavarosságaként és színváltozásaként láthatók (feltéve, hogy a közeghez fenolvörös, a legelterjedtebb nem mérgező pH-indikátor). A szokásos fénymikroszkópos vizsgálat is kimutatja a baktériumsejteket és a gombaszerkezeteket, így a tenyészetek napi mikroszkópos megfigyelése biztosítja a mikrobiális szennyeződés korai felismerését, és lehetővé teszi a megfelelő intézkedések megtételét, amint az első jelek nyilvánvalóvá válnak. Különösen a szennyezett kultúrák azonnali eltávolítása szükséges a szomszédos kultúrák, valamint a steril szövettenyésztési környezet - beleértve a tenyésztő inkubátorokat, fürdőket és a biológiai biztonsági szekrényt - védelme érdekében. Ezenkívül specifikus baktérium- és gombavizsgálatot a rutinszerű és rendszeres minőség-ellenőrzési szűrési eljárás.

A mikrobiális szennyeződések gyakori okai és megelőzése

.

A gyökér / ok	Megelőzés
Technika:
Manipulációk, pipettázás, adagolás
Nem steril felületek és berendezések		Tisztítsa meg a munkaterületet a nem közvetlenül használt tárgyaktól.
	Folyadék a palackok nyakán és külsején, valamint a munkafelületen	Rendszeresen törölje le 70%-os alkohollal. Ne öntse ki a folyadékokat. Adagolja ki pipettával, automatikus adagolóval vagy átadóeszközzel. Ha a kiöntés elkerülhetetlen: (1) tegye ezt egyetlen egyenletes mozdulattal, (2) dobja el a palackot, amelyből öntött.
A pipetta hegyének megérintése vagy túl közel tartása, a palackok nyakának megérintése, csavaros kupakok belseje	A pipettákat a beosztások fölé tartsa. Kezelje a steril pipettákat a hüvely fölé tekert hüvelyen keresztül.
Hulladékpohárból való visszacsobbanás		A hulladékot tölcsérrel dobja egy pohárba, vagy, ha lehetséges, használjon vákuumot a hulladék elszívására.
	A kultúrára vagy palackra ülepedő por vagy bőrrészecskék; nyitott tányér, palack, edény fölé tartott kéz vagy készülék		Nem szabad átadni a kezet, nyitott edények fölött dolgozni Ne dolgozzon nyitott palack vagy edény fölött (függőleges lamináris áramlás és nyitott pad) vagy mögött és fölött (vízszintes lamináris áramlású elszívó).
A kezelő haja, keze, lehellete, ruházata
Por a bőrről, hajról vagy ruházatról, amelyet a kultúrába ejtettek vagy fújtak	Mosson alaposan kezet, viseljen szöszmentes laborköpenyt. Kizárólag a tenyésztőhelyiség számára fenntartott laborköpenyt használjon. Hosszú haját kösse hátra, vagy viseljen sapkát. Arccal elforduljon a munkától, ha beszélgetésre van szükség.
Beszélgetésből, köhögésből, tüsszentésből stb. származó aeroszolok.		Kerülje a megfázásos munkát, vagy viseljen maszkot.
Anyagok és reagensek
Solutions
Nem steril reagensek és közegek	Szűrje vagy autoklávozza az oldatokat használat előtt.
Nem megfelelő sterilizálási eljárások		Figyelje az autokláv teljesítményét regisztráló hőmérővel vagy sterilitásjelzővel. Szennyeződés gyanúja esetén vizsgálja meg vagy tenyéssze meg a sterilizált oldatokat.
Hiányos minőségellenőrzés a kereskedelmi beszállítónál		Beszerezze mediát, puffereket, szérumokat csak jó hírű, minőséget és forrást igazoló beszállítóktól.
üvegáruk és csavaros kupakok
Por és spórák a tárolásból	Fóliával lefedett kupakok. Törölje át a palackokat 70%-os alkohollal, mielőtt bevinné őket a páraelszívóba.
Műszerek, pipetták
Visszaélhetetlen sterilitás	Használjon egyenként csomagolt, steril, eldobható készleteket jó hírű beszállítótól. Használat előtt száraz hővel sterilizálja az újrafelhasználható eszközöket.
Egy nem steril felülettel vagy más anyaggal való érintkezés		Ne fogja meg az eszköz vagy pipetta olyan részét, amely a tenyésztőedénybe kerül.
	Kultúrlombikok és tápfolyadékos palackok használat közben
Por és spórák az inkubátorból vagy a hűtőszekrényből	Dugók helyett csavaros kupakokat használjon. Tamponozza le a palackokat, mielőtt a motorháztetőbe helyezi. Használjon másodlagos tárolóedényt a lemezekhez.
Szennyes tárolási vagy inkubációs körülmények		Tárolás vagy inkubáció alatt fedje le az üvegek kupakját és nyakát alumíniumfóliával. Rendszeresen tisztítsa ki a tárolókat és az inkubátorokat.
Média a kupak alatt és a palack külsejére terjedve	Vesszen el minden olyan palackot, amelynek nyakán kívülről kifolyt folyadék található. Ne öntse ki.
Készülékek és létesítmények<
Szoba levegője
Légáramlatok, örvények, turbulencia, por, aeroszolok	Szövet/sejtkultúra számára megfelelő helyet kijelölni Csökkentse a forgalmat és az idegen tevékenységet. Törölje rendszeresen a padlót és a munkafelületeket.
Lamináris áramlású biológiai biztonsági szekrények
Perforált szűrő		Rendszeresen ellenőrizze a szűrőket lyukak és szivárgások szempontjából.
Mocskos szűrő		Ellenőrizze a szűrőn keresztüli nyomásesést.
Kiszivárgások, különösen a résekben vagy a munkafelület alatt		Rendszeresen fertőtlenítse a munkafelület környékét és alját. Hagyja, hogy az alkohol a résekbe folyjon.
CO2 párásított inkubátorok
	Tisztítsa rendszeresen a gyártó előírásai szerint, megfelelő fertőtlenítéssel.
Pórusok stb, kényszerített légkeringetésen szállított	A nyitott edényeket zárja műanyag dobozokba, szorosan illeszkedő fedéllel (de ne zárja le a fedeleket).
Fürdők és egyéb berendezések
Szennyeződés az oldatok melegítésére használt vízfürdőkben	Tisztítsa és fertőtlenítse a vízfürdőt rendszeresen; törölje át az edényeket alaposan 70%-os alkohollal, mielőtt száraz állapotban a biológiai biztonsági szekrénybe helyezi át használatra.
Por a gázpalackokon, szivattyúkon stb.		Figyeljen arra, hogy nem vízalapú (gyöngyös) melegítőfürdőt használjon. Törölje át 70%-os alkohollal a tenyésztőterembe való belépés előtt.
Biológiai anyagok behozatala
Beérkező sejtvonalak
Szennyeződés gyanúja a forrásnál vagy a szállítás során		Egyedül kezelje ezeket a sejtvonalakat, lehetőleg karanténban. Ellenőrizze a szennyeződést úgy, hogy két hétig antibiotikumok nélkül tenyészti a kultúrát. Ellenőrizze a szennyeződést vizuálisan, fázis-kontraszt mikroszkópiával és Hoechst/DAPI festéssel a mikoplazma kimutatására.

Mycoplasma

A mikoplazmák olyan baktériumnemzetség, amely nem rendelkezik sejtfallal, ezért nem hatnak rájuk az antibiotikumok, amelyek a sejtfal kialakulásának gátlásával korlátozzák a baktériumok növekedését. Rugalmas morfológiájuk és a 0,15-0,3 µm közötti sejtméretük azt jelenti, hogy elkerülhetik a szabványos sejtkultúra-szűrési módszereket, amelyek gyakran 0,22 µm-es pórusú szűrőket használnak. A legtöbb más bakteriális szennyeződéstől eltérően a mikoplazmák nem tűnnek fel véletlenszerű szemrevételezéssel, és morfológiájuk és feltűnően kis méretük miatt fénymikroszkópiával nehéz kimutatni őket. A tenyészetben a mikoplazma titer elérheti a 10⁸ organizmus/mL-t anélkül, hogy a közeg zavarosságát okozná. Általában nem pusztítják el az általuk megfertőzött emlőssejteket, de jelentősen befolyásolják a tenyészeteket azáltal, hogy megváltoztatják a sejtek anyagcseréjét, kromoszóma-rendellenességeket okoznak, lassítják a sejtnövekedést és zavarják a sejtek kötődését. Röviden, valószínűleg drámaian befolyásolják a legtöbb, az érintett sejtvonalakkal végzett kísérlet eredményeit.

2. ábra. Az olyan gyakori DNS-kimutató szerek, mint a DAPI vagy a Hoechst, fluoreszcens mikroszkópiával mutatják ki a mikoplazma jelenlétét a fertőzött kultúrákban (jobbra).

A laboratóriumban a mikoplazma-szennyezés változatos forrásai kihívást jelenthetnek. Mivel bizonyos mikoplazmafajok az emberi bőrön is megtalálhatók, a rossz aszeptikus technika révén is bejuthatnak, emellett a szennyezett kiegészítőkkel, például fetal bovine serum révén is bejuthatnak.   A mikoplazma nagymértékben átvihető a szomszédos szennyezett sejtkultúrák között. A médiumok és pufferek 0,1 µm-es vagy annál kisebb pórusú membránokkal történő szűrése szükséges a mikoplazma kezeléséhez, mivel a 0,22 vagy 0,45 µm-es pórusú standard médiaszűrő eszközök nem zárják ki ezeket a kis organizmusokat.

A mikoplazma-szennyeződés megelőzése, kimutatása és megszüntetése

Amint a mikoplazma megfertőz egy tenyészetet, gyorsan átterjedhet a laboratórium más területeire. A szigorú betartása a a jó laboratóriumi gyakorlat kulcsfontosságú, és a mikoplazma-szennyezés sikeres ellenőrzéséhez erősen ajánlott a mikoplazma rutinszerű vizsgálata. A három legnépszerűbb kimutatási módszer a következő mycoplasma tenyésztés, DNS-festési módszer és PCR-alapú kimutatás. Számos megoldást kínálunk a  Mycoplasma kimutatás és elimináció. A tenyészetek mikoplazma-szűrési rutinjának kialakítása még akkor is kritikus fontosságú, ha nem gyanakszik e szennyezőanyag jelenlétére a laboratóriumban.

Mikrobiális fertőzés megelőzése:  az antibiotikumok jelentik a megoldást? A szövettenyésztésben az egyik az antibiotikumok rutinszerű alkalmazása, akár önmagukban, akár gombaellenes szerekkel koktélokban. Az orvosok által felírt terápiás antibiotikumokhoz hasonlóan az antibiotikumok folyamatos vagy nem megfelelő alkalmazása olyan rezisztens törzsek kialakulásához vezethet, amelyeket nehéz kiirtani, és amelyek a sejttenyészetekre nézve toxikus, későbbi generációs antibiotikumok alkalmazását tehetik szükségessé. A legújabb tanulmányok további aggodalmakat vetettek fel a tenyésztett sejtekben antibiotikumok jelenlétében bekövetkező megváltozott génexpresszió lehetőségével kapcsolatban.

Vírusfertőzés

A vírusok a legnehezebben kimutatható sejtkultúra-szennyeződések közé tartoznak a tenyészetben, olyan mikroszkópos módszereket igényelnek, amelyek a legtöbb kutatólaboratórium számára kivitelezhetetlenek. A vírusok származhatnak a beteg vagy a gazdaszervezet állati sejtforrásából, és számos biotechnológiai jelentőségű sejtvonalról kimutatták, hogy endogén retrovírusokat tartalmaz.  Gyakrabban előfordul, hogy a sejtek a tenyésztésükhöz használt állati eredetű anyagokban jelen lévő vírusoktól fertőződnek meg. A vírusok kis mérete miatt nagyon nehéz eltávolítani őket a táptalajokból, szérumokból és más biológiai eredetű oldatokból. Mivel azonban a legtöbb vírus gazdaszervezet-, sőt szövet-korlátozott, ez korlátozhatja a fajok vagy szövetek közötti fertőzésre való képességüket. Bár a vírusok sokkal gyakoribbak lehetnek a sejtkultúrákban, mint azt sok kutató gondolná, a sejtkultúrában nem jelentenek jelentős zavaró tényezőt, ha nem okoznak citopátiás vagy más káros hatást a sejtekre.

A tenyésztett sejtekre gyakorolt hatásuk mellett a vírusfertőzött sejtkultúrák használatának egyik fő aggálya a laboratóriumi személyzetre jelentett potenciális egészségügyi kockázat. Az emberből vagy más főemlősökből származó szövetekkel vagy sejtekkel való munka során mindig különleges biztonsági óvintézkedéseket kell alkalmazni, hogy elkerülhető legyen a vírusfertőzés (többek között HIV, hepatitis B, Epstein-Barr, simian herpes B vírus) lehetséges átvitele a sejtkultúrákból a laboratóriumi személyzetre. A potenciálisan veszélyes szövetekkel, kultúrákkal vagy vírusokkal való munka eljárásairól konzultálni kell az intézmények környezetbiztonsági felelőseivel. A sejtkultúrákkal dolgozó laboratóriumi személyzet kockázatértékeléséről bővebben, klikk ide

A sejttenyészetek vírusfertőzésének csökkentésére szolgáló legjobb gyakorlatok:
*Korlátozzuk azon biológiai források (beszállítók, állatok) számát, amelyekből sejteket nyerünk.
*Válasszunk kevésbé vírusérzékeny állatokat/sejteket.
*Beszerezzen sejteket olyan tárolóhelyekről, amelyek vírusvizsgálatot végeznek és tanúsítják a vírusmentes sejtvonalakat.

Kémiai szennyeződés

A sejttenyészet minden nem élő szennyeződését gyakran "kémiai" szennyeződésnek minősítik.  Ezek a szennyeződések származhatnak a médiumokban vagy pufferekben használt reagensekből vagy vízből, illetve a berendezésekből és kellékekből.  Példaként említhetők a szabad gyökök, fémionok, fertőtlenítőszer/mosószer maradványok, vagy akár endotoxinok, amelyek azután is fennmaradnak, hogy az upstream bakteriális szennyeződések már nincsenek jelen.

Tippek a kémiai szennyeződés megelőzésére:
*Mindig használjon laboratóriumi minőségű vizet pufferek és oldatok készítéséhez, valamint liofilizált reagensek reszuszpendálásához.
*Minden újrafelhasználható laboratóriumi edényt alaposan ki kell öblíteni és levegőn kell szárítani - a mosószer-maradványokra nincs hatással az öntözés.
*Kizárólag olyan beszállítóktól szerezzen be táptalajt, kiegészítőket és szérumot (FBS, FCS), amelyek endotoxinvizsgálati tanúsítványt biztosítanak.

Általános tippek és technikák a kontamináció megelőzésére és kiküszöbölésére

A biológiai biztonsági szekrényben való munkavégzés

A biológiai biztonsági szekrényben végzett munka során hasznos, ha nem feledjük, hogy a légáramlás kulcsfontosságú a steril környezet fenntartásában. Mind a hátsó, mind az elülső szellőzőnyílásokat mindig szabadon kell tartani a hatékony légáramlás érdekében. Minden gyakorlati eljárás előtt a szekrényt fel kell tölteni az összes szükséges anyaggal, hogy minimálisra csökkenjen a szennyező anyagok átvitelének lehetősége a kezelő ujján és kezén.

A légáramlás beindítása után legalább húsz percnek el kell telnie, mielőtt a felhasználandó tárgyakat a szekrénybe helyezné. Minden, a szekrénybe kerülő tárgyat először le kell permetezni 70%-os (v/v) steril alkohollal, és meg kell törölni legyintésmentes törlőkendőkkel annak érdekében, hogy a por és a részecskék ne kerüljenek be a szekrénybe. Biztosítsa, hogy a légáramlás jól beinduljon, mielőtt bármilyen tetejét vagy tartályát kinyitná, hogy a légáramlat megtisztíthassa a munkaterületet az esetlegesen behurcolt részecskéktől.

3. ábra. Munka a biztonsági szekrényben

Az aeroszolok kipipálása és megelőzése

Az eldobható műanyag pipetták - más néven szerológiai pipetták, amelyek 1-100 ml-es kapacitással kaphatók - nélkülözhetetlen eszközök a sejttenyésztésben. Ezeket egyenként kell becsomagolni a sterilitás biztosítása érdekében. Az alábbi útmutatások betartásával minimálisra csökkenthető a pipettázással kapcsolatos szennyeződés és biztonsági kockázat.

• Automata pipettázó segédeszközöket használjon, minden egyes pipettázó segédeszköz csak egyetlen szekrényben használható.  A szennyeződés elkerülése érdekében rendszeresen szerelje szét és fertőtlenítse a pipettázó segédeszközök részeit. Gondoskodjon arról, hogy a pipettasegédeszköz szűrőit jól tárolja és rendszeresen cserélje.
• Ahol csak lehetséges, használjon dugós pipettákat (a tetejükön pamuttal dugaszolva), különösen a közeg átvitelénél.  Kerülje a folyadéknak a pipetta dugójába való behúzását. Ha a dugó véletlenül nedvesedik, azonnal cserélje ki a pipetta segédszűrőt.
• A szerológiai pipetta érintésének teljes elkerülése érdekében csomagolja ki részben, illessze a végét a pipetta segédszűrőhöz, majd távolítsa el a papírhüvelyt.
• A szennyező aeroszolok keletkezésének elkerülése érdekében ne hozzon létre buborékokat a közegben vagy a pipettában.
  

Determinálás

A tenyésztési hulladékok, munkafelületek és berendezések fertőtlenítésére/fertőtlenítésére tervezett módszereknek nemcsak a kontaminációs kockázatot kell minimalizálniuk, hanem biztonságosnak is kell lenniük a laboratóriumi személyzet számára. A fertőtlenítőszerek koncentrált formáinak használatakor mindig viseljen megfelelő egyéni védőfelszerelést (PPE), például kesztyűt és szemvédőt. A kiválasztott kesztyűknek védeniük kell a kezelt anyaggal szemben. A gyártók táblázatai segítenek az adott feladathoz legmegfelelőbb kesztyű kiválasztásában. A főbb fertőtlenítőszerek csoportokba sorolhatók, és relatív előnyeik a következőképpen foglalhatók össze:

Nátrium-hipoklorit vagy fehérítő

• Jó általános célú fertőtlenítőszer
• Vírusok ellen hatásos
• Korrozív a fémekkel szemben - nem szabad fémfelületeken, például centrifugákon használni
/li>
• A szerves anyagok által könnyen inaktiválódik, ezért gyakran kell frissíteni
• Helyes kereskedelmi fehérítőszerrel 10%-os (v/v) oldatot készíthet a hulladékfolyadékban vagy felületfertőtlenítéshez

Alkohol (pl.Pl. etanol, izopropanol)

• Effektív koncentrációk:
• Előszeres koncentrációk:
• Elmosószer (pl: Ethanol esetében 70%, izopropanol esetében 60-70%
• Hatásos a baktériumok ellen. Az etanol a legtöbb vírus ellen hatásos, de a nem burkolt vírusok ellen nem
• Az izopropanol nem hatásos a vírusok ellen
• Az aldehidek irritáló hatásúak, ezért használatukat korlátozni kell

A fenolos alapú fertőtlenítőszereket kerülni kell, mivel az EU biocid termékekről szóló irányelv felülvizsgálati programjának részeként nem támogatják.

Hogyan végezze el az egészséges sejtek rutinszerű monitorozását

A sejtkultúrák monitorozása fontos része a mindennapi sejtkultúrának. Ez a bemutató segít elmagyarázni a sejtek monitorozásának alapjait, beleértve azt, hogy hogyan néz ki egy egészséges kultúra, a sejtkonfluencia és a sejtkultúra növekedésének különböző fázisai. A videó bemutatja a bakteriális és mikoplazma-szennyeződések gyakori jelzőit is.

Kapcsolódó termékek

Kultúramédia	Fetális szarvasmarha szérum	Mikroplazma-kimutatás	Pipettás tippek	Culture Flasks
Tripszin	Antibiotikumok	Hoechst festékfesték	Hoechst festékfesték	Etilalkohol	Pipetták
>Steril szűrés	Hitelesített sejtvonalak	Isopropil-alkohol

Hivatkozások

1. 2009. Identity crisis. Nature. 457(7232):935-936. https://doi.org/10.1038/457935b

2. Neimark J. 2015. Line of attack. Science. 347(6225):938-940. https://doi.org/10.1126/science.347.6225.938

3. Weiss RA. 1978. Why cell biologists should be aware of genetically transmitted viruses. Natl Cancer Inst Monogr. 48183-9.

4. Fogh J, Holmgren NB, Ludovici PP. 1971. A review of cell culture contaminations. In Vitro. 7(1):26-41. https://doi.org/10.1007/bf02619002

5. Merten O. 2002. 39(2):91-116. https://doi.org/10.1023/a:1022969101804

6. Freshney RI. Culture of Animal Cells. https://doi.org/10.1002/9780471747598

7. Fundamental Techniques in Cell Culture, Laboratory Handbook. [Internet]. Public Health England: Available from: https://www.phe-culturecollections.org.uk/media/101902/ecacc_lab_handbook.pdf

8. Emmett Barkley W. 1979. [4] Safety considerations in the cell culture laboratory.36-43. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(79)58125-7

9. Ryu AH, Eckalbar WL, Kreimer A, Yosef N, Ahituv N. 2017. Use antibiotics in cell culture with caution: genome-wide identification of antibiotic-induced changes in gene expression and regulation. Sci Rep. 7(1): https://doi.org/10.1038/s41598-017-07757-w