A kalcium jelentősége és felhasználása a szérummentes eukarióta, köztük a hibridoma és a kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtkultúrákban.
Miért használjunk kalciumot a sejtkultúrában?
A kalcium egy ionilag stabil kétértékű kation, amely a sejt tenyésztési közegekben hasznos és toxikus tulajdonságokkal egyaránt rendelkezik. A sejt tenyésztési táptalajok széles skálájának alkotórésze.
A klasszikus táptalajokban és származékaikban található kalcium koncentrációja 0-tól a BGJb Medium Fitton-Jackson Modification-ben, amelyet porcos embrionális csontok tenyésztésére fejlesztettek ki, 2 mM-ig terjed az MCDB media 201-ben, amelyet a Chick Embryo Fibroblasts, egy csatolt sejtvonal tenyésztésére fejlesztettek ki. Általános szabályként a legmagasabb kalciumkoncentráció a szérummal kiegészített, például FBS, klasszikus médiumokban található, amelyeket a kötődő sejttípusokhoz fejlesztettek ki. A szérum általában megvédi a sejteket az oxidatív károsodástól. A kalciumszint általában alacsonyabb a szérummentes médiumokban és az elsődleges és klónos sejttenyésztésre kifejlesztett médiumokban. Ennek oka az lehet, hogy az elsődleges sejtek és a klonális sűrűségben tenyésztett sejtek érzékenyek a kalcium toxikus beáramlására az oxidatív folyamatok által károsított sejtmembránokon keresztül, ami a szérummentes kultúramédiumok, valamint enzimatikus és mechanikai feldolgozás. Mivel a kalcium befolyásolja a sejtek jelátvitelét és differenciálódását, valamint a sejtek kötődését, a specifikus sejttípusok számára kifejlesztett médiumok jelentősen csökkentett kalciumszintet igényelhetnek.
A következő klasszikus média tartalmaz 1.8 mM kalciumot tartalmaz: (BME); CMRL-1066 médium; Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM); Glascow Minimum Essential Medium, GMEM; H-Y médium (Hybri-Max®); Medium 199; Minimum Essential Medium Eagle (EMEM); NCTC Medium; Swim's S-77 Medium; és Williams Medium E. Click's Medium; MCDB media 131 és Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) valamivel kevesebb kalciumot tartalmaznak, 1,67, 1,60 és 1,49 mM-ot.
L-15 Medium és Ames' Medium 1,26 és 1,49 mM-ot tartalmaznak.15 mM kalciumot.
ADMEM/Ham's Nutrient Mixture F-12 (50:50) médiumot gyakran használják alap médiumként a CHO sejtek biotechnológiai célú tenyésztéséhez szükséges saját és speciális médiumok kifejlesztéséhez. Ez a táptalaj 1,05 mM kalciumot tartalmaz, ami nagyon közel áll az MCDB 105 és 110 táptalajok 1,0 mM-os kalciumszintjéhez. Az MCDB táptalajt humán diploid sejtek klónikus növekedésére fejlesztették ki. Más klasszikus médiumok amelyeket primer sejtek tenyésztésére fejlesztettek ki, mint például a Nutrient Mixture Ham's F-12 Kaighn's Modification (F12K) (0,92 mM); McCoy's 5A Modified Medium (0.9 mM) és a Waymouth Medium MB (0,82 mM) szintén közel 1 mM kalciumot tartalmaznak.
A CHO sejtek számára kifejlesztett 302 MCDB médium 0,60 mM kalciumot tartalmaz. A Nutrient Mixtures, Ham's F-10 és F-12; és Serum-Free/Protein Free Hybridoma Medium (amely az F-12-n alapul) mind 0,30 mM kalciumot tartalmaz. Az RPMI-1640 0,42 mM kalciumot tartalmaz. A CHO-kultúrához használt médiumokban használt kalciumkoncentráció 0,30 és 1,05 mM között mozog. Az 1,05 mM kalciumot tartalmazó DMEM//F-12 (50:50) médiumot gyakrabban használják alapként a biogyártásban használt CHO médiumok fejlesztéséhez.
A keratinociták számára kifejlesztett 151-es és 153-as médiumok nagyon alacsony, 0,03 mM körüli kalciumtartalommal rendelkeznek. A keratinocitákhoz használt nagyon alacsony kalciumszintek azt mutatják, hogy a kalciumnak fontos szabályozó vagy differenciáló hatása lehet bizonyos sejttípusokra.
A kalciumszállítás kezelése összetett, de fontos követelmény a kultúramédiumok és a biogyártáshoz és a szövetmérnökséghez szükséges rendszerek fejlesztése során. A nem megfelelő kalciumkezelés befolyásolhatja a tenyésztett sejtek kötődését, differenciálódási állapotát és életképességét. A kalcium mint sejt kultúramédiumok adalékanyag részletesebb tárgyalását lásd alább.
A kalcium elsődleges funkciói a sejt tenyésztési médiumokban
.A kalcium számos létfontosságú sejtfunkcióban vesz részt, beleértve az enzimaktivitást, a kötődést, a mozgékonyságot, a szöveti morfológiát, az anyagcsere-folyamatokat, a jelátvitelt, a szaporodást és a specializált sejtek, például az izom- és idegsejtek elektrokémiai válaszait. Elsősorban az endoplazmatikus retikulumban (ER) tárolódik. Az ER lumenében kalciumot kötő fehérjék közé tartozik a fehérje-diszulfid-izomeráz, a kalretikulin, az endoplazmin és a retikulokalbin. A sejtek számos olyan, nem ER-lumenben lévő kalciumkötő fehérjét tartalmaznak, amelyek sejtaktivitásokat és jelátviteli kaszkádokat közvetítenek. Ilyen fehérjék például a kalbindinok, a troponin C, a kalmodulin és az S-100 fehérjék."
Kalcium sejtszignálok
A kalcium több szinten is részt vesz a receptorok által közvetített jelátvitelben. Elősegíti a protein kináz C kötődését a sejtmembránokhoz, és az ER-ből az inozitol 1,4,5-triszfoszfát által történő felszabadulásakor megköti és aktiválja a kalmodulint. A ciklikus nukleotidok, a cAMP és a cGMP második hírvivőként működnek. Az aktivált kalmodulin szabályozza a cikláz és foszfatáz enzimeket, amelyek e nukleotidok intracelluláris pooljait szabályozzák. Az aktivált kalmodulin szabályozza a sejtciklus progressziójában szerepet játszó protein kinázokat és foszfatázokat is
Cellakötődés és szöveti morfológia
A kalcium megkönnyíti a sejtek szubsztrátokhoz és egymáshoz való kötődését, és számos olyan sejtes eseményt közvetít, amelyek befolyásolják a sejtek mozgását, alakját és háromdimenziós szerkezetét. Modulálja a kadherinek, szelektinek és integrinek működését. Az adhéziós molekulák ezen családjai szabályozzák a homológ sejt-sejt, heterológ sejt-sejt és sejt-mátrix kölcsönhatásokat. A kalcium az ER-lumen belsejéből történő kapcsolódási események jelzéseiben is részt vesz.
Kalciumciklus
Az egészséges sejtek nagy koncentrációgradienst tartanak fenn az extracelluláris és intracelluláris kalcium között. A normális extracelluláris kalciumkoncentráció az 1-3 mM tartományban, az intracelluláris koncentráció pedig a mikromoláris tartományban, 0,1-0,2 µM között van. Különféle membrán transzportcsatornák szabályozzák a kalcium homeosztázist és modulálják a sejtek környezeti ingerekre adott válaszait. A kalciumtranszportcsatornák vagy a sejtmembrán integritásának károsodása a kalcium gyors beáramlását eredményezi. A sejtmembránok károsodásához nagymértékben hozzájárul a lipidperoxidáció, amelyet oxidatív stressz indít el. A kalcium felhalmozódása a sejteken belül romboló események kaszkádját közvetíti, beleértve az enzimfunkciók, az ion- és pH-egyensúlyok, valamint a kritikus organellumok, például a mitokondriumok működésének megváltozását. Amikor a membránkárosodás következtében a kalcium intracelluláris koncentrációja 0,5 µM fölé emelkedik, a sejt mitokondriumai elkezdenek dolgozni a kalcium citoplazmából való eltávolításán.
A kalciumnak a citoplazmából a mitokondriumokba történő szállítását egy kalcium uniporter közvetíti, amelyet a belső mitokondriális membránpotenciál vezérel. Ezt a membránpotenciált a mitokondriális mátrix és a mitokondriális intermembrán tér között fennálló pH-különbség hozza létre. Ahogy a kalcium az uniporteren keresztül belép a mátrixba, csökkenti a membránpotenciált. A mitokondriumok általában több transzporter segítségével távolítják el a kalciumot a mátrixból. Ezek közé tartozik egy nátrium-érzékeny, alacsony kapacitású transzporter; egy nátrium/kalcium transzporter és egy nagy vezetőképességű fázisátmeneti pórus. A nagy kapacitású fázisátmeneti pórus részben és reverzibilisen, vagy teljesen és irreverzibilisen megnyílhat. Amikor a mitokondriális mátrix kalciumszintje a sejtszignálfolyamatok során erőteljesen megnő, a megnövekedett mátrixkalcium-koncentráció hatására a nagykapacitású pórus megnyílik az iondiffúzióra. Amíg ez a pórus nyitva van, a kalcium kiszabadulhat a mitokondriális mátrixból, és protonok juthatnak be a mátrixba. Ez a mitokondrium belső membránjának átmeneti depolarizációjához vezet. A mátrixon belüli pH emelkedése hatására a nagy kapacitású pórus bezáródik, és az elektrontranszportlánc visszaállítja a membránpotenciált. ATP-szintézis csak akkor történhet, ha a membránpotenciál helyreáll. A kalcium körforgása a mitokondriumokon keresztül normális és szükséges élettani válasz a kalciumot mobilizáló ingerekre. Számos célt szolgál. Segít pufferelni a citoplazmában lévő kalcium hatásait azáltal, hogy gyorsan eltávolítja azt, amikor a koncentráció meghaladja a kb. 500 nM-ot. Az intra-mitokondriális kalcium aktiválja a TCA-ciklus számos enzimjét és serkenti a fokozott energiatermelést.
Kalcium-paradoxon és apoptózis
A sejtek normális esetben mM kalciumkoncentrációnak vannak kitéve toxikus következmények nélkül. Amikor az extracelluláris kalciumot egy időre eltávolítják a sejtekből, majd a sejteket újra kalciumnak teszik ki, néha kiterjedt sejtkárosodás és halál következik be. A paradoxon azzal magyarázható, hogy ez olyan körülmények között következik be, amikor a sejtek olyan körülményeknek is ki vannak téve, amelyek károsítják a sejtmembránokat. Ez a jelenség gyakran megfigyelhető, amikor a szöveteket hipoxiás állapot után újra oxigénnel látják el. A sejtmembránok oxidatív károsodása valószínűleg gyakori közvetítője ennek a hatásnak. A sejtek tripszinálásakor gyakran használnak kalcium kelátorokat, mint például az EDTA. A tripszin és az oxidáció hatására a sejtmembránok károsodása érzékennyé teheti ezeket a sejteket a kalcium által közvetített sejthalálra, amikor kalciumtartalmú közegbe szuszpendálják őket. A médiumok kalciumkoncentrációja általában a mM tartományban van, és a sejtmembrán mechanikai vagy kémiai sérülésből eredő károsodása a kalciumnak a sejtbe való szivárgásához vezethet. Amint az intracelluláris kalciumkoncentráció meghaladja az 500 nM-ot, a mitokondriumok aktívan felveszik azt. Mivel az extracelluláris kalciumkészlet nagy, a mitokondriumok nem tudják visszaállítani a normál intracelluláris kalciumkoncentrációt. Ahogy a mitokondriumok kalciumot vesznek fel, az ATP-szintézis leáll, a belső-mitokondriális membrán depolarizálódik, a mátrix pH-ja emelkedik, és a felesleges kalciumnak a membránátmeneti pórushoz való kötődése miatt az teljesen és visszafordíthatatlanul megnyílik. Amint ez a pórus teljesen kinyílik, események kaszkádja következik be, amely az apoptózist indukáló faktor és a citokróm c felszabadulásához vezet.
A kalcium kémiai tulajdonságai, amelyek hasznos szérummentes médiakiegészítő
A kalcium egy bőségesen előforduló kétértékű földfém, amely számos szilárd szervetlen formában létezik a természetben. A növényi és állati struktúrák, például a levelek, csontok, fogak és kagylók fontos alkotóeleme, és soha nem található meg kötötten.
A kalciummal kapcsolatos legnagyobb kémiai problémák a sejtkultúrában az oldhatóság és a biológiai hozzáférhetőség. A kalciumot gyakran adják a sejt kultúramédiumokhoz szabadon oldódó kalcium-kloridként. Az oldatba kerülve a kalcium újraeloszlik és társul a közegben lévő más ionokkal és molekulákkal. A sejttenyésztési rendszerekben számos olyan ion és molekula van, amelyekhez a kalcium kötődhet, és oldhatatlan vagy enyhén oldódó molekulákat képezhet.
Kalcium-foszfátok
A foszfor a sejttenyésztési rendszerekben elterjedt elem, amely bizonyos körülmények között hozzájárulhat a kalcium kicsapódásához. A szervetlen foszfor fiziológiás pH-n elsősorban monobázisos és dibázisos foszfátként létezik. A kalcium-foszfátok megközelítő oldhatósága hideg vízben a következő: monobázisos foszfát, Ca(H2PO4)2, 71mM; kalcium-dibázisos foszfát, CaHPO4, 1.7 mM és kalcium-tribázikus foszfát, Ca3(PO4)2, 0,06mM. pH 7,0-nál a foszfát körülbelül 61%-a a dibázikus formában van, pH 7,6-nál ez az arány körülbelül 87%-ra nő. A kalcium-foszfát oldhatósága ebben a formában körülbelül 1,7 mM, és a médiakészítményekben jellemzően használt legnagyobb koncentráció 1,8 mM. Ez arra utal, hogy a kalcium foszfátionok általi kicsapódása csak akkor jelenthet problémát, ha a pH-t bázissá teszik olyan tevékenységek során, mint például a bázistitrálás. A keletkező kalcium-tribázikus foszfát képződése a szűrés során kicsapódást és a kalcium esetleges elvesztését eredményezné.
Chelátorok
A sejttenyésztésben néha használnak olyan kelátorokat, mint a citrát és az EDTA. Az EDTA logaritási affinitása a kalciumhoz körülbelül 10,6, és gyakran használják a kalcium eltávolítására a sejtkultúrák közegéből, különösen akkor, amikor a sejteket leválasztják a szubsztrátról, vagy amikor a sejtek csomósodása problémát jelent. A citrát és az albumin körülbelül 3,6, illetve 2 log-affinitású kalciumot köt meg. A citrát az albuminhoz is kötődik. A citrát és az albumin együttesen a sejtkultúrás rendszerekben lévő kalcium jelentős részét megkötheti.
Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.
Még nem rendelkezik fiókkal?