Immunohisztokémiai eljárás paraffinba ágyazott szöveteken

1. ábra. Immunhisztokémiai festés

Immunohisztokémiai technika

Az immunhisztokémiai festés értékes eszköz a specifikus antigének kimutatására a szövetekben. A standard festési eljárás elvégzéséhez a szövetmetszetet először deparaffinizálni kell, majd rehidratálni, mielőtt az elsődleges ellenanyagot felhordjuk. Ezután enzimhez konjugált másodlagos antitesteket alkalmazunk, majd az enzim-specifikus szubsztrát hozzáadása után láthatóvá válik a specifikus festődés. Esetenként, ha gyenge vagy egyáltalán nem figyelhető meg festődés, szükség lehet az antigén "leleplezésére" enzimes emésztéssel.

Az alábbi eljárás a peroxidáz vagy alkalikus foszfatáz konjugátumok alkalmazását írja le a formalinnal fixált, paraffinba ágyazott szövetmetszetek immunhisztokémiai jelölése során.

Az alábbiakban ismertetjük a peroxidáz vagy alkalikus foszfatáz konjugátumok alkalmazását.

Reagensek és berendezések

Az alábbi anyagtáblázatban számos ilyen terméket talál.

1. Formalin-fixált, paraffinba ágyazott szövetszelvények
2. 0,01 M foszfátpufferes sóoldat, pH 7,4 (PBS) (termékszáma: PBS) (terméksz. P3813 vagy P4417-tabletta)
3. Szarvasmarha szérumalbumin (BSA) (termékszám. A9647)
4. Hígítószer: 1% BSA PBS-ben (termékszám  P3688)
5. Xilol (termékszám  247642, vagy termékszám. 534056)
6. Ethanol abszolút (termékszám  32221, csak Európában, vagy termékszám. E7023)
7. 0,1% tripszin (termékszám T7409) PBS-ben vagy tripszin tabletta (termékszám. T7168) 4mM CaCl2, 200 mm Tris, pH 7,7, vagy 0,1% proteáz (terméksz. sz. P5380) PBS-ben.
8. Mikrohullámú antigén visszanyerő oldat: 10 mM nátrium-citrát (termékszám  C8532) puffer pH 6,0, 1 mM EDTA (termékszám  ED4SS) pH 8.0
9. Primer ellenanyag
10. Option 1: Biotinilált másodlagos ellenanyag és ExtrAvidin-Peroxidáz (terméksz. sz.
    E2886) vagy ExtrAvidin-alkáli foszfatáz (E2636), vagy Option 2: Peroxidázzal vagy alkalikus foszfatázzal konjugált másodlagos ellenanyag
11. A peroxidázzal konjugált másodlagos ellenanyagok vagy ExtrAvidin-Peroxidáz használata esetén: 3% hidrogén-peroxid (ionmentesített vízben, frissen elkészítve 30%-os állományból).
12. Enzimszubsztrát: az enzimtől és a szükséges színtől függően (lásd Szubsztrátok).
13. A peroxidáz esetében: AEC festő készlet (termékszám  AEC101), DAB (termékszám. D4418 vagy D0426).
14. Az alkalikus foszfatázhoz: Fast Red TR/Naphtol AS-MX (termékszám:  B5655).
15. Mayer's hematoxilin (termékszám  MHS1)
16. Coplin festőedény (termékszám. S5641)
17. Mikrohullámú
18. Mikroszkóp

IHC protokoll lépései

1. Olaszféra előkészítése
2. Primer antitest reakció
3. Sekunder antitest reakció
4. Subsztrát előkészítés
5. Kifejlesztés
6. Counterstaining

Olaszféra előkészítése

• Deparaffinizálás és rehidratálás
• Antigén kinyerés - leleplezés
• Antigén kinyerés - leleplezés
/a>
• Az endogén peroxidáz inaktiválása
  

Deparaffinálás és rehidratálás

1. Tegye a tárgylemezeket 56-60 °C-os sütőbe 15 percre. (Vigyázat: A sütő hőmérséklete nem haladhatja meg a 60 °C-ot).
2. Visszük át xilolfürdőbe, és végezzünk két xilolváltást egyenként 5 percig.
3. Rázzuk le a felesleges folyadékot, és rehidratáljuk a tárgylemezeket két alkalommal friss abszolút etanolban egyenként 3 percig.
4. Rázzuk le a felesleges folyadékot, és helyezzük a tárgylemezeket friss 90%-os etanolba 3 percre.
5. Rázza le a felesleges folyadékot, és helyezze a tárgylemezeket 3 percre friss 80%-os etanolba.
6. Öblítse át a tárgylemezeket 30 másodpercig gyengén folyó csapvízben (kerülje a közvetlen vízsugarat, amely lemoshatja vagy fellazíthatja a metszetet).
7. Tegye a tárgylemezt további rehidratáláshoz PBS mosófürdőbe (30 perc. szobahőmérsékleten).

Antigén kinyerése - az antigén leleplezése

Megjegyzés:Ezt a lépést csak abban az esetben kell elvégezni, ha gyenge vagy egyáltalán nem történik festődés, vagy olyan antigének esetében, amelyeknél az elsődleges antitest specifikációjának megfelelően "maszkmentesítés" szükséges.

Az antitesttől és az antigéntől függően a visszanyerésnek több lehetséges módja van:

Enzimes visszanyerés:

1. Alkalmazzon 0,1% tripszint PBS-ben vagy 0,1% proteázt PBS-ben 2-30 percig 37 °C-on. Az inkubációs idő meghosszabbítása is fokozhatja a specifikus festődést. Öblítse le PBS-ben 10 percig.

Mikrohullámú visszanyerés:

1. Mossa le a tárgylemezeket ionmentesített H2O-val, és helyezze őket egy mikrohullámnak ellenálló, antigén visszanyerő oldatot tartalmazó műanyag festőedénybe. Győződjön meg róla, hogy a tárgylemezeket teljesen beborítja az oldat.
2. A mikrohullámú sütőt 5 percig nagy teljesítményen (~700 watt) üzemeltesse. Győződjön meg róla, hogy a tárgylemezeket még mindig beborítja a visszanyerő oldat, vagy adjon hozzá friss oldatot, és ismételje meg a mikrohullámú sütést.
3. Ez a folyamat 2-3 alkalommal megismételhető.
4. A következő lépés előtt hagyja lassan, szobahőmérsékleten hűlni legalább 20 percig.

Az endogén peroxidáz inaktiválása

Megjegyzés: Ezt a lépést csak peroxidáz-konjugált másodlagos antitestek vagy ExtrAvidin-Peroxidáz használata esetén kell elvégezni.

1. A tárgylemezeket helyezze sík, vízszintes felületre. Ne hagyja, hogy a tárgylemezek összeérjenek. Semmiképpen se hagyja, hogy a metszetek kiszáradjanak.
2. Adjon annyi csepp 3%-os hidrogén-peroxidot, hogy az egész metszetet befedje.
3. Inkubáljon 5 percig. szobahőmérsékleten.
4. Öblítse le PBS-szel egy mosóflakonból.
5. Tegye a tárgylemezt 2 percre PBS mosófürdőbe.

Primary Antibody Reaction

Note:

a. A minta előinkubálása 5%-os BSA-val 10 percig az elsődleges antitestreakció előtt csökkentheti a háttérfestődést. Az állati szövetek esetében a legjobb eredmény elérése érdekében használjon 5-10% normál szérumot ugyanabból a fajból, mint a másodlagos ellenanyag gazdája.
b. Az optimális hígítást és inkubációs időt minden egyes primer ellenanyaghoz meg kell határozni a felhasználás előtt.

1. Hagyja a tárgylemezeket lecsöpögni, rázza le a felesleges folyadékot élénk mozdulattal, és óvatosan törölje át minden tárgylemezt a metszetek körül.
2. Hígítsa az elsődleges ellenanyagot vagy a negatív kontroll reagensét az optimális hígításra hígítóban. A hígítószer önmagában is használható negatív kontrollként. Egy pozitív kontroll tárgylemezt (olyan szövetet, amelyről ismert, hogy tartalmazza a vizsgált antigént) is el kell végezni.
3. A megfelelő tárgylemezekre 100 µl primer antitest oldatot kell felvinni, a szövetszelvényeket befedve.
4. Mindegyik tárgylemezt két különböző irányba kell dönteni, hogy a folyadék egyenletesen eloszoljon a tárgylemezen.
5. Inkubálni legalább 60 percig 37 °C-on, párásított kamrában. Alacsony sűrűségű antigének esetén hosszabb inkubáció javasolt.
6. Öblítse le óvatosan PBS-szel egy mosóflakonból. Helyezze a tárgylemezt 5 percre PBS mosófürdőbe.

Secondary Antibody Reaction

• 1. lehetőség - Biotin/ExtrAvidin kimutatás
• 2. opció - Enzim-jelölt másodlagos antitest

1. opció - Biotin/ExtrAvidin detektálás

1. Hagyja a tárgylemezeket lecsöpögni, rázza le a felesleges folyadékot, és óvatosan törölje le a tárgylemezt, mint korábban.
2. Hígítsa fel a biotinilált másodlagos ellenanyagot hígítóban az optimális koncentrációra.
3. Alkalmazzon 100 µl-t minden egyes tárgylemezre, a szövetszelvényeket lefedve.
4. Döntse meg az egyes tárgylemezeket két különböző irányba.
5. Inkubáljon legalább 30 percig párakamrában. szobahőmérsékleten.
6. Öblítse le óvatosan PBS-szel egy mosóflakonból.
7. Tegye a tárgylemezt 5 percre PBS mosófürdőbe.

ExtrAvidin reakció

1. Hagyja a tárgylemezeket lefolyni. Rázza le a felesleges folyadékot, és óvatosan törölje le a tárgylemezt, mint korábban.
2. Hígítsa az ExtrAvidin peroxidázt vagy az ExtrAvidin alkalikus foszfatázt, hígítóban az optimális koncentrációra.
3. Adjon 100 µl-t minden tárgylemezre; fedje le a metszetet.
4. Döntse meg az egyes tárgylemezeket két különböző irányba.
5. Inkubáljon párásított kamrában legalább 20 percig szobahőmérsékleten.
6. Öblítse le óvatosan PBS-szel egy mosóflakonból.
7. Tegye a tárgylemezt 5 percre PBS mosófürdőbe.
8. Ugrás a Subsztrát előkészítés és fejlesztés lépésre.

2. lehetőség - Enzimekkel jelölt másodlagos antitest

1. Hagyja a tárgylemezt lefolyni. Rázza le a felesleges folyadékot élénk mozdulattal, és óvatosan törölje le a tárgylemezt, mint korábban.
2. Hígítsa a peroxidázzal vagy alkalikus foszfatázzal konjugált másodlagos ellenanyagot a hígítóban az optimális hígításig.
3. Alkalmazzon 100 µl-t minden tárgylemezre, a szövetszelvényeket befedve.
4. Döntse meg az egyes tárgylemezeket két különböző irányba.
5. Inkubáljon 30 percig szobahőmérsékleten vagy 37 °C-on párásított kamrában.
6. Öblítse le óvatosan PBS-sel egy mosóflakonból.
7. Tegye a tárgylemezeket 5 percre PBS mosófürdőbe.

Subsztrát előkészítése

A szubsztrátkeveréket az utolsó mosási lépés során ajánlott elkészíteni.

Megjegyzés: 1 mM levamisol hozzáadása (termékszám. L9756) hozzáadása az alkalikus foszfatáz szubsztrátoldathoz nagymértékben gátolja az endogén alkalikus foszfatáz aktivitást (kivéve a bélben lévő izoenzimét)

Development

1. Az egyes tárgylemezeket hagyja lefolyni. Rázza le a felesleges folyadékot, és óvatosan törölje le a tárgylemezt, mint korábban.
2. Vigyen fel annyi cseppet a frissen elkészített szubsztrátkeverékből, hogy a szövetszelvényt ellepje.
3. Inkubáljon 5-10 percig, vagy amíg a mikroszkóppal megfigyelve a kívánt színreakció megfigyelhető. Fejezze be a reakciót, mielőtt a negatív kontrollokban háttérfestés jelenne meg, óvatosan öblítse le desztillált vízzel egy mosóflakonból.

Counterstaining

Megjegyzés: AEC szubsztrát használata esetén ne használjon alkoholtartalmú oldatokat az ellenfestéshez (pl.g., Harris' hematoxilin, savas alkohol), mivel az ezzel a módszerrel képződő AEC-festék szerves oldószerekben oldódik. A tárgylemezt nem szabad dehidratálni, toluolba (vagy xilolba) visszavinni, vagy toluol tartalmú montírozószerekben rögzíteni.

1. A metszetet elegendő Mayer-féle hematoxilinnel kell befedni, vagy a tárgylemezt Mayer-féle hematoxilin fürdőbe kell helyezni.
2. 0,5-5 percig inkubálni, a használt hematoxilin erősségétől függően.
3. Öblítse át a tárgylemezt óvatosan desztillált vízzel egy mosóflakonból.
4. Öblítse át a tárgylemezt finoman folyó csapvíz alatt 5 percig (kerülje a közvetlen vízsugarat, amely lemoshatja vagy fellazíthatja a metszetet).
5. Montsa a metszeteket vizes montírozóközeggel, például glicerolos zselatinnal. A fedőszalagot tiszta körömlakkal lehet lezárni.

Hivatkozások

1. Cuello A. 1993. Immunohistochemistry II. 1. Wiley.