Tippek és technikák az immunhisztokémiai (IHC) hibaelhárításhoz

• Mintakészítés: A sikeres IHC alapja
• Antigén kinyerése
• Megőrzés
• Detection
• Az eredmények elemzése: Fluoreszcens vs. fénymikroszkópia
• Hibaelhárítás az IHC eredményekkel kapcsolatos problémák esetén

Az immunhisztokémia (IHC) egy olyan technika, amelyben antitesteket használnak egy antigén kimutatására szeletelt szövetben, és mindenütt jelen van a kutatásban, preklinikai és klinikai környezetben a sejtkomponensek vizualizálására. Ezt a technikát, amelyet először az 1940-es években alkalmaztak, széles körben használják a szövetekben differenciálisan expresszálódó fehérjék eloszlásának és lokalizációjának jobb megértésére.

Az IHC végrehajtásának lépései, valamint számos eszköz és reagens évtizedek óta viszonylag változatlanok maradtak. Az egyszerű IHC protokoll alapvető lépéseinek megértése azonban még nem garancia a konzisztens, értelmezhető képek elkészítésére. Az optimalizálás és a finomhangolás a siker kulcsa egy új célpontra vonatkozó IHC-protokoll kidolgozásakor.

Az IHC protokoll általánosított lépései egyszerűek:

• Proba előkészítése
• Antigén kinyerése
• Blokkolás
• Primer antitest festés
• Detektálás
• Az antitestek festése
• Detektálás

A lépések egyszerűnek tűnnek, de a protokollok és a reagensek optimalizálása jelentheti a különbséget az egyáltalán nem történő festés és a merész festés között, amely megváltoztathatja a kutatás útját. Az alábbiakban K+F;D hisztológusaink és antitest validálással foglalkozó tudósaink nyújtanak néhány betekintést azokba az optimalizációkba, amelyek segítenek elkerülni a gyakori IHC-problémákat annak érdekében, hogy a leghasznosabb adatokat és publikálható képeket kapja, függetlenül a választott technikától.

1. ábra. Fénymikroszkópos kép az anti-PIR antitest IHC-validálásáról FFPE humán hólyagszelvényeken diaminobenzidin (DAB) enzimes kimutatással (barna kromogén) és hematoxilinnel (kék) történő ellenfestéssel.

2. ábra. A nem-foszforilált patkány neurofilament H (kat. sz. NE1023, zöld) fluoreszcens mikroszkópos kimutatása patkányagy fagyasztott metszeteinek fluoreszcens festésével. Kék, Hoechst 33342.

1. táblázat. IHC mintaelőkészítési lépések szövetmegőrzési módszerrel.

IHC protokoll lépés	Fagyasztott minták		FFPE minták
Szövetgyűjtés/fixálás/td>	Optionális perfúziós fixálás	formalin
Minták beágyazása	fagyasztóközeg	paraffin
Szövetek szeletelése	Krionosztát	mikrotom
-20 °C tárolás	x
Deparaffinizálás/rehidratálás		x
Antigén kinyerés		x
Endogén enzimek blokkolása		x

2. táblázat. IHC festés (immundetektálás) elemzési módszerrel.

IHC protokoll lépés	Fluoreszcens IHC		Enzimatikus detektálás fénymikroszkópiához
Festés előtt pufferben mossuk a tárgylemezeket	x	x<
Blokkolás a nemspecifikus jel megelőzésére	x	x
Primer antitest inkubáció	Egyetlen primer, vagy primer koktél	x
Mossuk a metszeteket 3x puffercserével	x	x
Inkubáljuk másodlagos ellenanyaggal	Fluoreszcens konjugátum - több célponthoz is lehet koktél	x
x
Mossuk a szelvényeket 3x puffercserével	x	x
	Inkubálás enzimatikus szubsztráttal		x<
Olaszkópokat ionmentesített vízbe mártjuk		x
Nukleáris ellenfesték	DAPI vagy Hoechst (kihagyjuk, ha a hordozóközeg tartalmazza)	hematoxilin
Mossuk 2-3x deionizált vízben		x
A metszetek dehidratálása		EtOH és xilol
Fedőlemezzel való fedés	x	x
Tárolja a csúszkákat a fénytől távol	x

Mintakészítés: A legtöbb szövettanász egyetért abban, hogy a megfelelő mintaelőkészítés, amely nemcsak a szöveti morfológiát, hanem a célepitóp(ok)at is megőrzi, minden sikeres IHC-eljárás alapja. A protokoll jelentősen változik attól függően, hogy fluoreszcens vagy fénymikroszkópos elemzést tervezünk-e.

Szövetgyűjtés és fixálás

A megfelelő és hatékony szövetgyűjtés és konzerválás az IHC-hez megóvja a sejt- és szövetmorfológiát, miközben megállítja a proteolitikus és mikrobiális degradációt. Az IHC céljára történő szövetkonzerválás két fő módszere a gyorsfagyasztás és az FFPE (formalinban rögzített, paraffinba ágyazott).

A fagyasztott szövetkészítményeknél a szöveteket gyorsan nem vizes közegbe gyűjtik, majd nagyon hideg hőmérsékleten kriosztáton szeletelik. Az FFPE-készítmények a meghatározatlan ideig tartó tárolás kényelmét és a paraffinblokkokba ágyazott szövetek szobahőmérsékleten történő metszését kínálják mikrotoméval.

Kriontakarékosság

A friss szövetet közvetlenül a boncolást követően gyorsan le kell fagyasztani hűtött izopentánban (2-metilbután) vagy egy ezzel egyenértékű alternatívában. A gyors fagyasztás elengedhetetlen a szövetet károsító jégkristályok kialakulásának megelőzése érdekében. A lefagyasztott szövetet ezután -80 °C-on tároljuk a metszésig. Nagyméretű szövetek, például emberi szervek esetében a szövetet először kisebb blokkokra kell szeletelni a gyorsabb és a szövet teljes térfogatában egyenletes fagyasztás elősegítése érdekében.

A felolvasztás után és a vágás előtt a fagyasztott szövetet fagyasztóközeggel ellátott formákba ágyazzák, amely a kriosztát tokmányához való tapadásra is szolgál, és lehetővé teszi, hogy a fagyasztott szövet ellenőrzött módon érintkezzen a metszőpengével. A szöveteket a vágás előtt 30 percig hagyni kell egyensúlyba kerülni a kriosztátkamrában, hogy megkönnyítsék az egységes és reprezentatív szövetszeletek felvételét. A szeleteléshez szükséges optimális kriosztát-hőmérséklet a szövet típusától és a fagyasztási protokolltól függ. A kriosztátos metszés minden szakaszában ügyeljen a szövetek orientációjának követésére. Minden egyes metszet elkészítése után óvatosan helyezze a metszetet egy fagyasztott üveglemezre. Egy fagyasztott ecset és egy gördülésgátló eszköz használata (sok gyakorlással együtt) segít elkerülni a szövetszelvény gördülését, hajtogatását, gyűrődését és szakadását.

Az antigén kinyerése

Az FFPE hatékony és megbízható módszer a szövetek morfológiájának hosszabb ideig történő, környezeti hőmérsékleten történő megőrzésének biztosítására, ugyanakkor ez a formátum számos célepitópot hozzáférhetetlenné tesz az antitestek kimutatásához. Az FFPE szövetmetszetekben lévő antigének az alábbi visszanyerési módszerek valamelyikével álcázhatók:

• HIER (hőindukált epitóp visszanyerés): A tárgylemezre helyezett szövetszelvényeket egy speciális melegítési sorozatnak vetik alá, egyidejű nyomásemeléssel egy citrát pufferben. Ezt egy nyomáskonyhához hasonló készülékben érik el
• PIER (proteáz-indukált epitóp visszanyerés--- más néven EIER, enzim-indukált epitóp visszanyerés) egy 37 °C-on inkubált enzim - proteináz K, tripszin vagy pepszin - alkalmazására utal.  TIPP: Néhány tárgylemez esetében az enzimoldat közvetlenül a tárgylemezekhez adható; a legtöbb esetben azonban a reagens koncentrációját, a hőmérsékletet és az inkubációs időt úgy lehet a legjobban szabályozni, ha az összes feldolgozandó tárgylemezt egyidejűleg az enzimet tartalmazó fürdőbe merítjük.

Tartás

Az IHC-hez szükséges antitestek kiválasztása

Specifikusság: Az elsődleges antitestek kiválasztása a hatékony IHC kritikus lépése. Az egyik különösen fontos szempont az antitestspecifikusság, amely biztosítja, hogy az antitest csak az érdeklődésre számot tartó fehérjéhez kötődjön. A specificitás értékelésének arany standardja az a megállapítás, hogy a festődés hiányzik azokban a szövetekben, amelyekből az adott fehérjét kiiktatták, bár más módszerek, mint például egyetlen sáv jelenléte, ha Western blotting, szintén léteznek. A másodlagos ellenanyag kiválasztásakor mindig biztosítani kell, hogy a másodlagos specifikus legyen arra a fajra, amelyből az elsődleges ellenanyagot eredetileg nyerték. Számos további tényező határozhatja meg a másodlagos antitest hatékonyságát, ezek közé tartozik az elsődleges antitesthez való epitópspecifikusság, a tisztítási módszerek, valamint az, hogy az antitest felszívódik-e keresztreaktív immunglobulinokkal szemben.

Alkalmazási alkalmasság: A jó hírű antitest-szállítók általában feltüntetik azokat az immunodetektálási alkalmazásokat, amelyekre az antitestet validálták, és adatokat kell szolgáltatniuk az IHC/ICC (immuncitokémiai) eredmények bizonyítására. Például azok az antitestek, amelyek sikeresen jelölnek egy epitópot a Western blotting denaturált körülményei között, nem feltétlenül teljesítenek az IHC során, ahol a natív fehérje konformációja gyakran megmarad.

Klónalitás: A monoklonális antitestek egyetlen plazmasejt bővítéséből származnak, és ezért egyedi epitópot ismernek fel. Míg a monoklonális antitestek specifitást biztosítanak, a poliklonális antitestek jobb választás lehetnek, ha a célfehérje alacsony szinten expresszálódik, mivel több epitópot ismernek fel, és ezért nagyobb érzékenységet biztosítanak.Ezzel szemben a poliklonális antitestek gyártási folyamata természetüknél fogva nagyobb tételenkénti eltéréseket eredményez a termék specifikációin belül.

Host source: A negyedik fontos antitest szempont az a gazdafaj, amelyet az antitest előállításához használtak. A keresztreaktivitás elkerülése érdekében elengedhetetlen, hogy az antitestet a vizsgált szövettől eltérő szövetben neveljék.  Az elsődleges antitest gazdafaját a detektálás során a másodlagos antitesthez is hozzá kell igazítani.

Blokkolás: Az antitest nem specifikus kötődése a legfontosabb szempont, amikor az antigénnek az elsődleges antitest által történő immunodetektálásáról van szó.  Az antigének nem specifikus detektálása a másodlagos antitest által azonban a szubsztrát hozzáadása utáni lépés után is jelentős hátteret eredményezhet.  A háttérfestés csökkentésének és az antigénspecificitás biztosításának kritikus lépése az elsődleges antitest hozzáadása előtti blokkoló lépés beépítése. A blokkoló oldatnak ideális esetben a másodlagos antitest fajának megfelelő szérumot kell tartalmaznia.

Detektálás

A detektálás jellemzően két módszer egyikével történik: a) kolorimetrikus vagy enzim-közvetített detektálás és b) fluoreszcencia alapú detektálás.

A kolorimetriás módszerben a kötött primer vagy szekunder antitestet egy szubsztráthoz konjugálják, amely egy enzim által átalakítva egy kicsapódó terméket ad. Ez a csapadék fénymikroszkópos vizsgálat során színes festésként látható.

A fluoreszcencia alapú kimutatási módszerben a szövetben lévő, érdekes antigénhez kötött antitestet közvetlenül vagy közvetve egy fluorofórhoz (néha fluorokrómnak is nevezik) konjugálják, egy olyan molekulához, amely egy meghatározott hullámhosszúságú fény jelenlétében fluoreszkál.

Eredmények elemzése: Fluoreszcens vs. fénymikroszkópia

Fluoreszcens mikroszkópia

Az immunfluoreszcens ICC és az IHC egyaránt megköveteli a minta elemzéséhez használt epifluoreszcens vagy konfokális mikroszkóp konfigurációjának ismeretét. A legjobb eredmény akkor érhető el, ha az elsődleges vagy másodlagos antitesthez konjugált fluorofór spektrális jellemzői illeszkednek a rendelkezésre álló mikroszkóp gerjesztő forrásához (általában lézer) és emissziós szűrőjéhez. A fluoreszcens mikroszkópiás elemzési kísérlet megtervezéséről bővebben ezen az oldalon olvashat.

Fénymikroszkópia

A fehérfény- vagy fénymikroszkópia talán könnyebben hozzáférhető a kutatók számára, mivel a szükséges felszerelés a legtöbb laboratóriumban rendelkezésre áll, de korlátozza az egyidejűleg ugyanazon szöveti metszetben detektálható célpontok száma.  Ennek oka, hogy a kromogén lerakódása a szövetben az antitest antigénhez való kötődésének helyén az enzim-szubsztrát aktivitástól függ, és a legelterjedtebb, megbízható reagensek (mint például a diaminobenzidin vagy DAB és az alkalikus foszfatáz vagy AP) nem kínálnak olyan multispektrális kolorimetrikus detektálást, amely lehetővé tenné több célpont egyidejű kimutatását.

Az IHC-eredményekkel kapcsolatos problémák megoldása

A következő táblázatban az IHC-eredményekkel kapcsolatos néhány gyakori problémát mutatunk be, a lehetséges magyarázatokkal és a technikai korrekcióra/optimalizálásra vonatkozó javaslatokkal együtt.

probléma	lehetséges ok	megoldás
Gyenge vagy egyáltalán nincs festődés	Antigén nincs jelen a szövetmintában		Nézze át az irodalmat, hogy megerősítse, hogy a célpont expresszálódik-e a szövetmintában. Vagy ellenőrizze az mRNS-expressziót in situ hibridizációval.
Gyenge vagy nincs festődés	Az antitest lebomlása		Az antitesteket kisebb térfogatokban tárolja, hogy minimalizálja az ismételt fagyasztási-olvasztási ciklusokat, valamint a melegedésnek és fénynek való kitettséget (fluoreszcens antitestek esetében). Tárolja a gyártó által ajánlott módon.
Nagyon gyenge vagy egyáltalán nem festődik		Nem elégséges primer antitest kötődik a mintához		Koncentráltabb primert használjon; növelje az inkubációs időt
Nem megfelelő szövetfixálás		Gondoskodjon arról, hogy a szövetet a gyűjtés után azonnal fixálószerrel rögzítse a megfelelő koncentrációban és hőmérsékleten, valamint megfelelő ideig.
Gyenge vagy nincs festődés		Az antitest antigénhez való hozzáférhetetlensége a túlfixálás vagy a szövet vagy a célszemély számára nem megfelelő fixálószerrel történő rögzítés miatt		Rövidítse a fixálás időtartamát; próbálja meg 4 °C-on rögzíteni a szövetet, és növelje az időtartamot, ahelyett, hogy rövidebb ideig rögzítené a szövetet környezeti hőmérsékleten.
Szegény vagy egyáltalán nem festődik	Primer & másodlagos antitestek nem kompatibilisek	Vizsgálja meg, hogy az elsődleges antitest gazdafajára specifikus másodlagos antitest
Szegény vagy nincs festődés	Hibás kimutatási reagensek		Friss enzimatikus vagy egyéb reagenseket készítsen.
Szegény vagy egyáltalán nem festődik	Enzim-szubsztrát reakcióképesség; a szubsztrátpuffer nem megfelelő pH-ja		A deionizált víz tartalmazhat peroxidáz inhibitorokat, amelyek csökkenthetik az enzimaktivitást. Használjon a specifikus szubsztrátokhoz ajánlott pH-tartományban lévő puffert.
Gyenge vagy egyáltalán nem festődik		A primer antitest esetleg nem alkalmas immunhisztokémiai alkalmazásra		Az ajánlott alkalmazásokhoz és a támogató adatokhoz nézze meg az adatlapot vagy a gyártó weboldalát
Nagyon gyenge vagy nem festődik		A deparaffinizálás nem volt elegendő	A metszeteket friss xilol használatával hosszabb ideig desparaffinálja.
Gyenge vagy egyáltalán nem festődött	Eredménytelen antigén-visszanyerés		HIER esetén ellenőrizze a hő- és nyomásviszonyokat, PIER esetén a reagensek integritását; vagy próbálkozzon más visszanyerési módszerrel.
Szegény vagy egyáltalán nem festődik	Az adalékok kihagyása vagy nem a megfelelő sorrendben történő alkalmazása		Az eljárás megismétlése a protokoll gondos figyelembevételével
Szegény vagy egyáltalán nem festődik	Az antitestet inkompatibilis pufferben hígították -- például egyes monoklonálisok a hígítópuffer ionerőssége miatt nem képesek megkötni a célpontot		A TBST általánosan kompatibilisebb lehet, mint a PBS, kivéve fluoreszcens alkalmazások esetén Értékelje a festést fagyasztott szöveteken különböző fixálószerekkel (EtOH, aceton stb.)	/td>
Gyenge vagy egyáltalán nem festődik	FFPE szövetek antitesttel inkompatibilisek		Kerülje az azidot, amely HRP inkompatibilis a pufferekben. A TBST nem kompatibilis az AP detektálással.
Gyenge vagy nincs festődés	A puffer nem kompatibilis az enzimmel		A HIER-ben lévő visszanyerési puffer pH-ját a célpontra kell optimalizálni. Alacsony pH jobb lehet nukleáris célpontok esetében, magas pH citoplazmatikus / membrán célpontok esetében.
Gyenge vagy nincs festődés	Az antigén visszanyerés nem megfelelő		Egyes célpontok, különösen glikoprotein vagy kollagén célpontok esetében a PIER és / vagy a HIER együttes alkalmazása előnyös lehet. Rövidítse le vagy szüntesse meg a visszanyerést, mivel a HIER vagy a PIER ritka esetekben elpusztíthatja vagy megváltoztathatja magát a céltárgyat. Ha a HIER vagy a PIER nem használható, próbálkozzon inkább permeabilizálással (pl. 0,3-0,5% Triton X-100 ) a blokkolás előtt.
Szegény vagy egyáltalán nem festődik	A peroxidáz blokkolás gátolja a célpont festődését		A peroxidáz blokkolás lépését helyezze át az elsődleges inkubáció utánra (bizonyos CD markerek esetében szükséges lehet).
Túlfestett szövet	Túl magas a primer és/vagy a szekunder antitest koncentrációja		Az optimális primer antitest-koncentrációt szomszédos metszetek festésével határozza meg, csak a primer antitest koncentrációját változtatva.
Túlfestett szövet	Túl hosszú a másodlagos inkubációs idő		A másodlagos antitest inkubáció >60 perc általában nem fokozza a jelet, és nemkívánatos eredményhez vezethet Optimalizálja az időtartamot az egyes komponensekkel: antitest, szubsztrát, enzim stb.
Túlfestett szövet		A primer és/vagy másodlagos reagensek nem specifikus kötődése a szövetekhez		A szöveteket úgy kell kezelni, hogy a nem specifikus kötődést minimalizálja vagy blokkolja.
magas háttér/nem specifikus kötődés		A szövetekben nagy mennyiségű endogén molekula lehet, amelyek az inkubációs keverékekben is jelen vannak. Például a vérsejtekben lévő peroxidáz a szövetekben maradhat.		Kísérelje meg az inkubálást az elsődleges ellenanyag forrásától eltérő fajból származó normál szérummal. Interferáló peroxidázt tartalmazó szövetek esetén: kezelje a szövetet 3%-os H2O2-vel vagy 0,3%-os hidrogén-peroxiddal metanolban 30 percig szobahőmérsékleten.
Nagy háttér/nem specifikus kötődés	Nem megfelelően mosott szövet		Mosd legalább 3x foszfát pufferelt sóoldattal (PBS) 2-5 percig minden egyes festési reagens lépés után	Mosd legalább 3x foszfát pufferelt sóoldattal (PBS) 2-5 percig
magas háttér/nem specifikus kötődés	Szekunder antitest keresztreaktivitás vagy nem specifikus kötődés	A másodlagos antitest erős vagy mérsékelt affinitást mutathat magához a szövethez. Például a tárgylemezek bevonására néha használt tojásfehérje nagy mennyiségű avidint tartalmaz. Kerülje a tojásfehérje használatát, hogy megakadályozza, hogy az avidin a festés során biotinilált másodlagos antitesthez kötődjön.
magas háttér/nem specifikus kötődés		A szövetszelvények a protokoll egy bizonyos pontján kiszáradhattak	A metszeteket az IHC protokoll során mindig tartsa nedvesen
magas háttér/nem specifikus kötődés	Az endogén peroxidázok vagy foszfatázok magas szintje		A megfelelő inhibitor használata a peroxidáz- vagy foszfatáz-aktivitás blokkolására, amelyek zavarhatják a HRP-, illetve az AP enzimatikus kromogén módszereket
Nagy háttér/nem specifikus kötődés
Nagy háttér/nem specifikus kötődés	A primer antitest gazdafajta ugyanaz a faj, mint a szövetmintáké		Válasszon olyan primer antitestet, amelyet nem az IHC-vel elemezni kívánt szövetek fajában tenyésztettek ki
Változott szöveti morfológia		Az antigén visszanyerési technika túl kemény volt	Kipróbáljon egy másik módszert, vagy optimalizálja a módszert, hogy a hő- vagy enzimes körülmények kevésbé legyenek kemények
Változott szövetmorfológia	A fagyasztott metszetek leválnak a tárgylemezről		Növelje a fixálási időt. Használjon frissen előkészített tárgylemezeket
Változott szövetmorfológia		Nincs felbontás a metszeteken az egysejtű rétegek szintjén.	Vékonyabb metszeteket készítsen
Változott szövetmorfológia		A szövet nem ép/sérültnek tűnik	Növelje a fixálási időt; használjon kisebb szövetdarabokat. A fixálóanyagnak be kell jutnia a szövet belsejébe.