Reprodukálhatóság biológiai pufferekkel
Mi a biológiai puffer?
A biológiai pufferek olyan szerves anyagok, amelyek a hidrogénionok hatásának semlegesítésével egy adott tartományban állandó pH-t tartanak fenn. A puffereket általában biokémiai, biológiai és környezeti vizsgálatokban használják egy oldat savasságának egy kívánt fiziológiai tartományon belül tartására vagy szabályozására, vagy akár egy adott reakció beindítására. Az anyagok pH-ja nemcsak a kémiai reakciók sebességét és hatékonyságát befolyásolja, hanem a termékek visszanyerését és tisztaságát is. A biológiai vizsgálatokban a pH hatással van a fehérjék szerkezetére és működésére, az enzimatikus reakciókra és a sejtek anyagcseréjére. Ezért a pufferek jelentősen hozzájárulnak az ilyen vizsgálatok eredményéhez. A biológiai vizsgálatokban leggyakrabban használt pufferek a zwitterionos N-szubsztituált aminosav-származékok, amelyeket biológiai puffereknek vagy Good puffereknek is neveznek.1,2
A biológiai pufferek kritériumai
Noha az alábbi követelmények közül egyik biológiai puffer sem teljesíti az összeset, többségüknek várhatóan megfelelnek:
- pKa 6,0 és 8 között.0, egy olyan tartomány, ahol a legtöbb biológiai reakció zajlik
- magas vízoldékonyság és alacsony szerves oldószeroldékonyság, amelyek aránya meghatározza a puffer eloszlását a vizes közeg és a biológiai fázis között
- Alacsony lipidoldékonyság a biológiai membránok átjárhatatlanságával
- Minimális hatás a puffer disszociációjára a hőmérséklet, az ionerősség és a koncentráció bármilyen változása esetén
- Nem képez komplexeket nyomfémekkel, alkálifémekkel vagy más ionokkal
- Minimális hatás a puffer disszociációjára
- Nagy stabilitás az enzimatikus lebomlással szembeni ellenállással; nem hat enzimgátlóként vagy szubsztrátanalógként
- Nem nyeli el a fényt a látható vagy UV spektrumban, amelyet elsősorban a spektrofotometriás vizsgálatokban használnak
- Minimális kölcsönhatás a sóval és a kritikus reakcióalkotókkal< /li>
- Költséghatékony és könnyen előállítható
A preklinikai kutatások alacsony reprodukálhatósági aránya
A reprodukálhatóság arra a képességre utal, hogy a kutatási kísérletek során pontosan ugyanazokat az eredményeket lehet előállítani, pontosan ugyanazok az anyagok és eljárások felhasználásával. A publikált felfedezések eredeti eredményeinek reprodukálása kulcsfontosságú az orvosbiológiai kutatóközösség számára, hogy következtetéseket vonhasson le, és új kutatási területeket tárhasson fel, amelyek terápiás alkalmazásokba torkollhatnak. Végső soron az ilyen elvesztegetett idő és lehetőségek negatívan befolyásolják az életmentő terápiák és gyógymódok felfedezését.
A reprodukálható kutatás azonban régóta komoly kihívást jelent a tudományos közösségben, mivel sok kutató a további vizsgálatok elvégzéséhez a meglévő alapkutatási információkra támaszkodik, amelyek nem feltétlenül megbízhatóak, és hibás feltételezésekhez, valamint jelentős idő- és pénzveszteségekhez vezethetnek. Leonard P. Freedman, a Global Biological Standards Institute elnöke és társszerzői 2015-ben publikálták a "The Economics of Reproducibility in Preclinical Research" (A reprodukálhatóság gazdaságossága a preklinikai kutatásban) című tanulmányt, amely becslések szerint évente megdöbbentő 28 milliárd dollárt költenek olyan preklinikai orvosi kutatásokra, amelyek nem reprodukálhatók.
A kutatások reprodukálhatóságának kudarca és a hibás premisszákon alapuló követő kutatások nemcsak erőforrásokat és pénzeszközöket pazarolnak el, hanem hatással lehetnek a kutatók és a kutatóintézetek hírnevére és karrierlehetőségére is, valamint negatív hatással lehetnek a folyóiratok hírnevére és olvasottságára.
A közelmúltban több publikáció is rávilágított a preklinikai kutatás alacsony reprodukálhatósági arányának problémájára. 2012-ben az Amgen tudósai arról számoltak be, hogy 53 "mérföldkőnek számító" preklinikai vizsgálatból csak 6-ot tudtak reprodukálni, ami a tudományos közösségben több vitát eredményezett a reprodukálhatósági probléma mértékéről és a probléma leküzdésére irányuló kezdeményezések kidolgozásáról.
A reprodukálhatatlanságot általában a vizsgálat megtervezése, a laboratóriumi protokoll pontatlansága, a rossz adatelemzés és jelentéstétel, valamint a felhasznált biológiai reagensek és referenciaanyagok alkalmatlansága okozhatja.3 Az alábbi kép a reprodukálhatatlanság legfontosabb forrásait és a válság nagyságrendjét szemlélteti.
A reprodukálhatatlanság forrásai - a költség magas
1. ábra. Az USA preklinikai kutatásra fordított becsült kiadásai és a reprodukálhatatlansághoz hozzájáruló hibakategóriák. [Megjegyzendő, hogy a hiba százalékos értéke minden egyes kategória esetében az adott kategóriára vonatkozó magas és alacsony előfordulási becslések középpontja osztva (súlyozva) az összes középponti hibaarány összegével].
A "A transzlációs kutatás második éves helyzetéről" szóló felmérés 2014-ben készült, amelyben a résztvevők arra a kérdésre válaszoltak, hogy mely termékcsoportok okozzák a legtöbb nehézséget a kutatás reprodukálhatóságával kapcsolatban. A felmérés eredményeiből kiderült, hogy az állatmodellek, az antitestek, a sejtvonalak, a PCR-reagensek és primerek, a sejtkultúra-reagensek, a fluoreszcens címkék, a festékek, a pufferek és az oldószerek okoztak a legnagyobb gondot.
A puffereket széles körben használják számos protokollban és alkalmazásban az alapkutatásban, az ipari gyógyszeriparban és a biofarmáciai piacon. E pufferek kiválasztásának és minőségének változékonysága jelentős hatással lehet a kutatás reprodukálhatóságára. Ezért nagy szükség van a kiválasztásukkal és használatukkal kapcsolatos jobb megértésre és képzésre.
Biológiai puffer kiválasztási útmutató
A legtöbb biológiai folyamat pH-függő, és a pH bármilyen kis változása a biológiai funkció, a biomolekula stabilitásának és a kísérlet eredményének változásához vezethet. A puffer fő célja egy biológiai rendszerben az, hogy ellenálljon a belső és külső hatások okozta pH-változásnak, és az intracelluláris és extracelluláris pH-t egy szűk tartományon belül tartsa.
A pufferek potenciális akadályai két kategóriába sorolhatók:
a. Tételenkénti eltérés a pufferrel
- Víztartalom: A tételenkénti eltérés megváltoztathatja az oldat koncentrációját, ha a puffereket lemérik és nem korrigálják a víztartalomra.
- Morfológia: A pufferkomponensek kristályos termékek, amelyek a részecskeméret, a részecskeforma, az őrlési jellemzők és a csomagolási sűrűség tekintetében eltérésekkel rendelkeznek. Ez hatással lehet az infravörös (IR) vizsgálatra. Például a HEPES polimorf, és 2-3 különböző morfológiában létezhet; ennek megfelelően az IR-szkennelése is változhat. Ezért fontos a megfelelő puffer kiválasztása, ha az IR-szkennelést használják jellemzési kritériumként.
- nyomelemek: A nyomelemek jelenléte hatással lehet a biológiai rendszerekre és a sejtkultúrára. Például a Cu, a Zn és a Se jelenléte kritikus az emlőssejtkultúra teljesítményében az antitestgyártás során, és befolyásolhatja a terápiás antitestek hozamát.
- Szintézisből származó szennyeződések: A számos szerves puffer szintézise során keletkező melléktermékek és műtermékek, például a polivinil-szulfonsav (PVS) és a szabad aminok befolyásolhatják a biológiai folyamatok teljesítményét, beleértve az enzimek aktivitását, a fehérjeaggregációt és a bioaktív tulajdonságokat.
A pufferek nagy tisztasága kritikus fontosságú a nyomelemek, kémiai szennyeződések és biológiai szennyeződések minimális szintjének biztosítása érdekében, amely biztosítja a tételek közötti konzisztenciát a jobb reprodukálhatóság érdekében.
b. Kölcsönhatások a biológiai rendszerekkel
Bár a biológiai pufferekről feltételezik, hogy minimális kölcsönhatásban vannak a környezeti és biológiai rendszerekben jelen lévő fémionokkal, számos tanulmány a közelmúltban ennek ellenkezőjét mutatta ki. Ezért lényeges megérteni, hogy ezek a pufferek hogyan lépnek kölcsönhatásba a fémionokkal és más biológiai anyagokkal, például a fehérjékkel.
Egy olyan enzim például, amelynek aktivitásához fémionokra van szüksége, gátolt lehet, ha a használt puffer oldhatatlan komplexet képez ezekkel a fémionokkal. A komplexeknek ezért oldhatónak kell lenniük, és kötési állandójuknak ismertnek kell lennie. A foszfátok kétértékű fémekkel oldhatatlan sókat képeznek és kicsapódnak. Ezért a foszfátpufferelt só (PBS) oldatot soha nem autoklávozzuk Ca2+ vagy Mg2+-val. A biológiai pufferek, mint például a PIPES, TES, HEPES és CAPS, nagyon alacsony fémkötési állandóval rendelkeznek, és különösen alkalmasak fémfüggő enzimek vizsgálatára. A Bis-Tris propán, az ADA és a Tris azonban mind erősen kölcsönhatásba lép a különböző fémionokkal.
Az alábbiakban áttekintést adunk a különböző fém-puffer párok2 komplexképződési erősségéről :
:
2. ábra. Fém-puffer párok - komplexképzés
- Zöld = Nincs komplexképződés, általános használatra alkalmas
- Yellow = Light complexation
- Cyan = Az adatok nem egyeznek (További vizsgálatok vagy óvatosság szükséges)
3. ábra. Kölcsönhatás fémekkel - Puffer alkalmassága
- Cyan = Általános használatra alkalmas
4. ábra. A reprodukálhatóság javítása pufferekkel
1. Tippek a puffer kiválasztásáhoze):
:
- A kutatók számára a puffer kiválasztásához az első hivatkozási alapnak a korábbi irodalomnak, protokollnak és/vagy szabványos működési eljárásoknak kell lennie a feltételek, például a pH, a hőmérséklet stb. optimalizálása érdekében.
- A puffer célját és az esetleges későbbi alkalmazásokat is érdemes figyelembe venni. Például egyes pufferanyagok, mint az ACES és az ADA, különböző hullámhosszúságú fényt nyelhetnek el, ami befolyásolhatja a downstream méréseket.
- A pufferanyag optimális kiválasztása annak érdekében, hogy a puffer pKa értéke közel legyen a kívánt pH-hoz a pufferkapacitás maximalizálása érdekében, kulcsfontosságú. Egyéb aggályok is kezelhetők olyan pufferek kiválasztásával, amelyek mentesek mindenféle enzimatikus aktivitástól, különösen olyan termékkel, amely DNSse/RNSse vagy proteázmentes. Továbbá, ha a fémek aggodalomra adnak okot, olyan pufferanyagot válasszunk, amely alacsony fémszennyeződéssel rendelkezik, és nem kelátolja a fémeket.
- A kutatóknak gyakran kell adalékanyagokat, például sókat, detergenseket stb. használniuk a fehérjék stabilitásának javítása vagy az oxidáció-redukció vagy más aggregáció megakadályozása érdekében. Fontos felismerni az ilyen típusú adalékokkal való lehetséges puffer kölcsönhatásokat.
- Végezetül, alapvető fontosságú a szállító és a végső pufferanyag kiválasztása a piacon elérhető lehetőségek széles skálájából, beleértve a pufferminőségek és -minőségek széles választékát. Például a nem kritikus alkalmazásokhoz alacsony minőségű általános felhasználású puffereket lehet választani, a gyógyszergyártáshoz pedig a szigorúbb termékeket lehet gondosan kiválasztani. Ezen kívül számos különböző formátumot, például porokat, folyadékokat, koncentrátumokat vagy felhasználásra kész termékeket kell bölcsen megfontolni.
Az alábbi táblázat a különböző pufferfajtákat szemlélteti a downstream alkalmazás típusa szerint.
2. Tippek a pufferek előkészítésére, tárolására és felhasználására:
Az alábbiakban felsoroltak általános ajánlások, amelyek az alkalmazástól, az iparágtól, a szabályozási környezettől és egyéb tényezőktől függnek.
- A pufferek különböző kereskedelmi forgalomban kapható formátumok, mint például por, használatra kész termékek, folyékony koncentrátumok stb. E termékek szolubilizálásához vagy hígításához kiváló minőségű (fémionoktól, szerves anyagoktól, részecskéktől és egyéb szennyeződésektől mentes) vizet kell használni víztisztító rendszerek alkalmazásával, különösen a kritikus alkalmazások esetében. A pufferkészítés során figyelembe veendő további tényezők a felhasznált víz vezetőképessége/pH-ja és a munkakörülmények, például a hőmérséklet és az ionerősség, mivel ezek befolyásolják a pKa-t. Mivel nem minden puffer autoklávozható, szubmikronos szűrést lehet alkalmazni a szennyeződés és a növekedés megelőzésére.
- A puffer tárolására számos hivatkozás áll rendelkezésre, például a helyes laboratóriumi gyakorlatról (GLP) szóló útmutató és az USA-ban a szövetségi előírások elektronikus kódexe. Jó gyakorlat a pufferek megfelelő címkézése (az azonosság, a titer vagy a koncentráció, a tárolási követelmények és a lejárati idő feltüntetésével) annak érdekében, hogy a puffereket ne cseréljék fel, illetve ne használják fel tévesen a laboratóriumi vagy tárolási körülmények között. A lejárt, illetve zavarossá vagy elszíneződött puffereket kerülni kell, mivel azok nagy valószínűséggel szennyezettek. A gyártók által szállított pufferoldatok esetében a gyártók által ajánlott tárolási feltételeket kell követni.
- A puffereket lehetőleg közvetlenül a felhasználás előtt kell elkészíteni. Ha ez nem lehetséges, akkor a korábban ajánlott tárolási irányelveket kell követni. Mindig jó, ha a munkaoldatokat használat előtt megszűrjük, hogy biztosítsuk, hogy nem tartalmaznak szennyeződéseket vagy részecskéket.
3. Tippek a publikálási szempontokhoz
- Néhány publikációból hiányoznak a legfontosabb felhasznált reagensekre, köztük a pufferekre vonatkozó fontos információk. Sok publikáció megadja ugyan a pufferek szállítójának és márkájának adatait, de előfordulhat, hogy nem számol be számos információról, például a minőségről vagy a tisztaságról. A pufferek dokumentálására és jelentésére vonatkozó ajánlások tartalmazzák a puffer márkáját, a termékszámot, a minőséget vagy minőséget, valamint a tétel- vagy tételszámot. Ezenkívül a puffer összetétele, a munkakoncentráció és a reakciók körülményei, mint például a koncentrátum és a munkaoldat pH-ja, a hőmérséklet, amelyen a pH-t mértük, valamint a pH-mérő gyártója és modellje hozzájárulnak a kutatás reprodukálhatóságának javításához. Számos kiadó ma már felismerte az ilyen információk megadásának fontosságát, és kiegészítő adattárakat tesz elérhetővé a referenciaként.
Kutattunk és kifejlesztettünk egy hasznos referencia-útmutatót, amely egy interaktív puffertáblázat az egyes pufferek hasznos pH-tartományaira, a puffer munkakoncentrációira, a káros fémion kölcsönhatásokra, a pKa hőmérsékletfüggő változásaira, az adott anyaghoz kínált különféle termékekre vagy minőségekre, valamint a tervezett alkalmazásokra vonatkozó információkkal.
Célunk, hogy a globális tudományos közösséggel együttműködve megoldjuk az élettudományok legnehezebb problémáit. A kutatás reprodukálhatósági problémáinak kezelésével és tudatosításával reméljük, hogy segíthetünk a kutatóknak abban, hogy leküzdjék a tudományos vizsgálatok során felmerülő akadályokat.
BioPerformance tanúsított pufferjeink kényelmet, minőséget és reprodukálhatóságot kínálnak.
Hivatkozások
Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.
Még nem rendelkezik fiókkal?