Minta előkészítés és gélelektroforézis hibaelhárítás

Elektromos áram, vezetékek, vezetékek, fésűk, szivárgás... annyi lehetőség a bajra. De még mindig használunk géleket, mert az elektroforézis továbbra is hatékony módja a fehérjék szétválasztásának - így az antitest-alapú immundetektálás eredményei meglehetősen egyértelműek lehetnek.

Kattintson a Sample Preparation & Gel Electrophoresis témakörökre, ha olvasni szeretne a lehetséges okokról és azok orvoslásáról:

• No Bands or Gel Front
  
• A minta nem süllyed a kút aljára
  
• A minta kiszivárog a kútból
  
• A minták függőlegesen elkenődnek
  
• A minták függőlegesen elkenődnek
  
• Túl sok sáv
  
• A zselé szokatlanul lassan fut
  
• Szokatlanul gyorsan futó gél
  
• Túl közel vannak egymáshoz a fehérjeszalagok (nem teljesen megoldott)
  
• Túl közel vannak egymáshoz a fehérjeszalagok (nem teljesen megoldott)
  
• A gél bal és/vagy jobb szélső sávjai torzulnak
  
• A sávok mosolygó alakzatokat alkotnak

Nincsenek szalagok vagy gél előlap

Meglehetséges ok	Megoldás
A gélről lefolytak a fehérjék	Levonja a gél futtatásának időtartamát. Csökkentse a feszültséget. Győződjön meg arról, hogy a vezetékek helyes irányban vannak-e, mivel az elektroforézis vezetékek a tápegységhez fordítva lehetnek, ami a gél felfelé futását okozza. Növelje a gél akrilamidszázalékát.
Nem került elég fehérje a gélre	Töltsön több fehérjét az egyes mélyedésekbe. Győződjön meg arról, hogy az egyes minták fehérjekoncentrációja pontos.
A minta a teljesítmény alkalmazása előtt elszóródott a mélyedésekből< ./td>	Csökkentse a gél első mélyedésének betöltése és az elektroforézis megkezdése közötti időt. Ha szükséges, futtasson kevesebb gélt és/vagy kevesebb sávot egyszerre.
Nincs elég SDS a mintában	Megfelelő SDS nélkül a fehérjék nem rendelkeznek negatív töltéssel, és nem fognak átjutni a sejten. Biztosítsa a megfelelő SDS-koncentrációt.

A minta nem süllyed a kút aljára

Megoldás	Megoldás
Nincs elég glicerin a mintában	Növelje a glicerin koncentrációját.

A kútból szivárgó minta

Meglehetséges ok	Megoldás
A kutak megsérültek a fésű eltávolítása során	Óvatosan távolítsa el a gélfésűt, hogy elkerülje a kutak megbontását. A minta betöltése előtt óvatosan öblítse át a kutakat elektroforézis pufferrel a sérült kutak felismerése érdekében.
A minta betöltése során megsérült kutak	Óvatosan töltse be a mintát, ügyelve arra, hogy a pipettahegy ne érjen a kutak aljához vagy oldalához.

A szalagok függőlegesen elkenődnek

Meglehetséges ok	Megoldás
A fehérjék nem teljes oldhatósága megakadályozza, hogy a fehérjék a gélbe kerüljenek	Gondoskodjon a megfelelő szonikálásról/homogenizálásról és centrifugálásról a sejtlizátum előkészítése során a részecskék eltávolítása érdekében.
Fehérjék lebontása	Proteáz/foszfatáz inhibitorok hozzáadása/koncentrációjának növelése a sejtlizátum előkészítése során. Kerülje a sejtlizátum és a Western blot minták ismételt fagyasztási/olvasztási ciklusait.
Túl sok fehérjét töltöttek be A túl< sok fehérje betöltése SDS-PAGE (jobb szélső sáv)	Csökkentse a mélyedésenként betöltött fehérje mennyiségét. Biztosítsa a minta pontos fehérjekoncentrációját.
Túl gyors gélfutás	Növelje a gélfutási időt.
Rossz minőségű vagy régi gél	Használjon friss gélt.

Túl sok zenekar

Meglehetséges ok	Megoldás
Fehérje degradáció/td>	A sejtlizátum előkészítése során proteáz/foszfatáz inhibitorok hozzáadása/növelése. Kerülje a sejtlizátum és a Western blot minták ismételt fagyasztási/olvasztási ciklusait.
Fehérjeaggregáció	Gondoskodjon megfelelő DTT-koncentrációról, amely csökkenti a diszulfidkötéseket. Melegítse a Western blot mintákat vízfürdőben a gélre töltés előtt.

Szokatlanul lassan futó gél

Meglehetséges okok	Hengerlés
Túlságosan koncentrált pufferek	Hígítsa a puffereket.
Túl alacsony áram	Növelje a gélkészülék feszültségét.

Szokatlanul gyorsan futó gél

Meglehetséges okok	Megoldás
Túl híg pufferek	Koncentrálja a puffereket.
Túl magas áram	Csökkentse a gélkészülék feszültségét.

Túl közel vannak egymáshoz a fehérje sávok (nem teljesen megoldott)

Meglehetséges ok	Megoldás
Elégtelen futási idő	Futtassa a gélt hosszabb ideig.
Helytelen gél pórusméret	Gradiens gélt használjon (nagyobb akrilamidszázalék alul, mint felül), amely megfelelően felbontja a fehérjék szélesebb mérettartományát.

A gél bal és/vagy jobb szélső sávjai torzulnak

Meglehetséges ok	Megoldás
	Megoldás
td valign="top"> Peremhatások	Ne hagyjon üres kutakat. A nem használt kutakat töltse meg kis mennyiségű fehérjével, hogy elkerülje a szomszédos sávokra gyakorolt peremhatásokat.

A zenekarok mosolygó alakzatokat alkotnak

lehetséges ok	megoldás
Túlzott meleg Túlzott melegbr /> A gélfutás "mosolyog." Ezt a túl magas feszültség okozza. A célsávok is kifehérednek, amit az okoz, hogy a detektáló reagens túl magas koncentrációban van használva.	Futtassa a gélt alacsonyabb feszültségen, hosszabb ideig. Használjon hűtött puffereket, és futtassa a gélt hideg szobában vagy jégbe csomagolva.