Csapadékképzési eljárások

A fehérje kicsapása a 2-D elektroforézishez való mintaelőkészítés opcionális lépése. A kicsapást, majd a mintaoldatban történő reszuszpendálást általában arra használják, hogy a mintában lévő fehérjéket szelektíven elválasszák a szennyező fajoktól, mint például sók, detergensek, nukleinsavak, lipidek stb., amelyek egyébként zavarnák a 2D eredményt. A kicsapást követő reszuszpendálás arra is alkalmazható, hogy híg forrásból (pl. növényi szövetekből, vizeletből) koncentrált fehérjemintát készítsünk. Vegyük azonban figyelembe, hogy egyetlen kicsapási technika sem teljesen hatékony, és előfordulhat, hogy egyes fehérjék nem szuszpendálódnak könnyen a kicsapást követően. Így a mintaelőkészítés során alkalmazott kicsapási lépés megváltoztathatja a minta fehérjeprofilját. Ha a mintában lévő összes fehérje teljes és pontos reprezentációja elsődleges fontosságú, a kicsapást és a reszuszpendálást kerülni kell.

A Cytiva 2-D Clean-Up Kit használható a szennyező anyagok eltávolítására és a 2-D elektroforézis mintázat javítására. A fehérjéket kicsapjuk a kicsapási reagensek kombinációjával, míg a zavaró anyagok, például nukleinsavak, sók, lipidek vagy detergensek oldatban maradnak. A minták az IEF-hez a kívánt denaturáló oldatban reszuszpendálhatók. Minden készlet 50 darab, egyenként legfeljebb 100 µl mintát képes feldolgozni. Az 1.4.1. szakasz (Minták tisztítása a 2-D Clean-Up Kit használatával) ismerteti a kitet, és protokollt ad a használatához.

A 8. táblázat felsorol néhány használható kicsapási technikát. Ha a minta előkészítése kicsapást igényel, általában csak egy kicsapási technikát alkalmaznak.

8. táblázat. Csapadékkezelési eljárások.

A kicsapási módszer	Általános eljárás	Korlátozások
Ammónium-szulfátos kicsapás ("Kisózás") Nagy sókoncentráció jelenlétében a fehérjék hajlamosak aggregálódni és kicsapódni az oldatból. Sok potenciális szennyező anyag (pl. nukleinsavak) az oldatban marad.	A fehérjét úgy készítse elő, hogy a fehérjeoldat végső koncentrációja > 1 mg/ml legyen egy pufferoldatban, amely > 50 mM és EDTA-t tartalmaz. Adjunk hozzá lassan ammónium-szulfátot a kívánt százalékos telítettségig (44), és keverjük 10-30 percig. Pelletálja a fehérjéket centrifugálással.		Nagyon sok fehérje magas sókoncentrációban is oldható marad, ezért ez a módszer nem ajánlott, ha teljes fehérje reprezentációra van szükség. Ez a módszer azonban használható előfrakcionálásra vagy dúsításra. A maradék ammónium-szulfát zavarja az IEF-et, ezért azt el kell távolítani (45). Lásd az 1. szakaszt.5 a sók eltávolításáról (Desalting samples using Mini Dialysis Kit).
TCA kicsapás A TCA (triklórecetsav) nagyon hatékony fehérje kicsapószer.	TCA-t adunk a kivonathoz 10-20%-os végső koncentrációban, és a fehérjéket 30 percig jégen hagyjuk kicsapódni (46). Alternatív megoldásként a szöveteket közvetlenül 10-20%-os TCA-ba homogenizálhatjuk (35, 47). Ez a megközelítés korlátozza a proteolízist és más fehérjemódosításokat. Centrifugáljuk és mossuk a pelletet acetonnal vagy etanollal a maradék TCA eltávolításához.	A fehérjéket nehéz lehet reszolubilizálni, és előfordulhat, hogy nem reszolubilizálódnak teljesen. A maradék TCA-t acetonnal vagy etanollal történő alapos mosással kell eltávolítani. Az alacsony pH-jú oldatnak való hosszabb expozíció a fehérjék bizonyos mértékű lebomlását vagy módosulását okozhatja.
Acetonos kicsapás Ezt a szerves oldószert gyakran használják a fehérjék kicsapására. Sok szerves oldható szennyeződés (pl. detergensek, lipidek) oldatban marad.		A kivonathoz legalább három térfogat jéghideg acetont adunk. Hagyjuk a fehérjéket -20 ºC-on legalább 2 órán át kicsapódni. A fehérjéket centrifugálással (46, 48-50) pelletáljuk. A maradék aceton eltávolítása légszárítással vagy liofilizálással történik.	Az összes fehérje nem teljes visszanyerése. Az aceton és a csövek kompatibilitása problémát jelenthet.
Kicsapatás TCA-val acetonban A TCA és az aceton kombinációját gyakran használják a fehérjék kicsapására a 2-D elektroforézishez történő mintaelőkészítés során, és hatékonyabb, mint a TCA vagy az aceton önmagában.	Suszpendálja a lizált vagy bontott mintát 10%-os TCA-ban, acetonban, 0,07% 2-merkaptoetanollal vagy 20 mM DTT-vel. A fehérjéket legalább 45 percig -20 °C-on kicsapja. Pelletáljuk a fehérjéket centrifugálással, és mossuk a pelletet hideg acetonnal, amely 0,07% 2-merkaptoetanolt vagy 20 mM DTT-t tartalmaz. A maradék acetont légszárítással vagy liofilizálással távolítsuk el (5, 28, 34, 43, 51, 52).	A fehérjéket nehéz lehet reszolubilizálni, és előfordulhat, hogy nem reszolubilizálódnak teljesen. Az alacsony pH-jú oldatnak való hosszabb expozíció bizonyos mértékű fehérjebontást vagy -módosulást okozhat.
A fenolos extrakciót követő metanolos ammónium-acetáttal történő kicsapás Ez a technika hasznosnak bizonyult a nagy mennyiségű zavaró anyagot tartalmazó növényi minták esetében.	A mintában lévő fehérjéket vízzel vagy pufferrel telített fenolba extraháljuk. A fehérjéket 0,1 M ammónium-acetáttal metanolban kicsapjuk a fenolos fázisból. A pelletet többször mossuk ammónium-acetáttal metanolban, majd acetonnal. A maradék acetont bepároljuk (42, 43, 47, 53).	A módszer bonyolult és időigényes