DNS és RNS mennyiségi meghatározása

A nukleinsav-koncentráció és -hozam pontos meghatározása fontos az olyan downstream alkalmazásokhoz, mint a transzfekció, a klónozás, a PCR és az újgenerációs szekvenálás (NGS). Ezeknek az alkalmazásoknak gyakran meghatározott célnukleinsav-koncentrációval kell rendelkezniük az optimális teljesítmény érdekében. A pontatlan mennyiségi meghatározás növelheti a downstream vizsgálatok variabilitását és befolyásolhatja az eredmények minőségét. A DNS- és RNS-kvantitást az alábbi módszerek bármelyikével el lehet végezni:

• UV abszorbancia (optikai sűrűség)
• Fluoreszcencia-mérés nukleinsav-kötő festékekkel
• .Agaróz gélelektroforézis
• qPCR

DNS-kvantitáció meghatározása UV-abszorbancia segítségével

A nukleinsav-koncentráció és -tisztaság meghatározására egyaránt leggyakrabban használt technika az abszorbancia. Az abszorbancia mérések segítségével megbecsülhető a DNS vagy RNS koncentrációja a tisztított mintákban. Ennél a módszernél a nukleinsavmintát egy kvarcküvettába helyezzük, amelyet aztán az UV-spektrofotométerbe helyezünk. A kis térfogatú spektrofotométerek, mint például a NanoDrop™ műszer, a DeNovix DS-11 spektrofotométer és a Blue-Ray Bio EzDrop spektrofotométer lehetővé teszik az akár 1 µl-es mintatérfogat elemzését talapzat segítségével. Az UV-fény egy meghatározott úthosszon halad át a mintán, és a nukleinsavak koncentrációja közvetlenül kiszámítható a 260 nm-en mért abszorbanciaértékek mérésével egy vakpróbával szemben a Beer-Lambert-egyenlet segítségével:

A = εcl

melyben:

A = UV-abszorbancia
ε = hullámhosszfüggő extinkciós együttható
c = nukleinsav-koncentráció
l = fényút (cm)

Extinkciós együtthatók*:

• dsDNS (tiszta): (µg/ml)^-1 cm^-1
• ssDNS (tiszta): 0,020 (µg/ml)^-1 cm^-1
• ssDNS (tiszta): 0,027 (µg/ml)^-1 cm^-1
• ssRNS (tiszta): ^-1 cm^-1

*Megjegyzendő, hogy ez a képlet csak nagy nukleinsavmolekulákra érvényes, amelyek nukleotidok arányos összetételével rendelkeznek, mint például a genomi DNS vagy a plazmidok. Oligonukleotidok és más rövid nukleinsavmolekulák, például miRNS-ek esetében az extinkciós együtthatót az oligonukleotid szekvenciája alapján kell kiszámítani.

A pontosság javítása érdekében az A₂₆₀ mérést gyakran korrigálják a (320 nm-en mért abszorbanciával mért) zavarossággal a következő egyenlet segítségével:

Az abszorbancia mérések, szennyeződések és a nukleinsav tisztasága

A DNS-en vagy RNS-en kívül más molekulák is elnyelhetik a fényt a 260 nm-es tartományban. A fehérjékben jelen lévő aromás gyűrűkkel rendelkező aminosavak 280 nm-en nyelik el a fényt, ami befolyásolhatja a 260 nm-es abszorbancia méréseket. Ezenkívül a guanidin és más kaotróp sók vagy oldószerek jelenléte, amelyeket a szilícium-dioxid-alapú DNS- és RNS-tisztítási módszerekben a kötődéshez általában használnak, 230 nm-en nyelik el a fényt, és a kereszthatás révén magasabb 260 nm-es abszorbancia-méréshez vezethetnek. Ez arra utal, hogy ha szennyeződések vannak jelen, és az A₂₆₀ számot használják a hozam kiszámításához, a DNS mennyisége túlbecsült lehet.

A fehérjekontamináció értékeléséhez határozza meg a 260 nm-en (nukleinsav abszorbancia) és a 280 nm-en (a fehérje aminosavakban lévő aromás gyűrűk abszorbanciája, bár a fenol is 280 nm-en abszorbeál) mért abszorbancia arányát. A jó minőségű DNS A₂₆₀/A₂₈₀ aránya 1,7-2,0 között lesz. A jó minőségű RNS A₂₆₀/A₂₈₀ aránya ~2,0.

DNS tisztaság (kémiai szennyeződések) = A₂₆₀ olvasat ÷ A₂₃₀ olvasat

Fluorometriás módszerek a kvantitációhoz

A fluorometriás módszereket széles körben a nukleinsav-kvantitásra rendelkezésre álló legérzékenyebb módszerek között tartják számon. Ezek a módszerek olyan fluoreszcens festékeket használnak, amelyek interkalálódnak és nukleinsavbarázdákat kötnek, nem specifikusan kötik a DNS-t vagy az RNS-t, vagy szelektíven kötik a nukleinsavakat. A nukleinsavhoz kötött fluoroforok spektrális jellemzőinek különbségei lehetővé teszik a minta koncentrációjának meghatározását.


Minden nukleinsavfestéknek van egy specifikus gerjesztési és emissziós hullámhossza. A DNS- vagy RNS-mintát fluorométerrel mérik, majd a nukleinsav-koncentrációkat a minta fluoreszcencia-kibocsátásának az ismert nukleinsav-koncentrációjú standardok felhasználásával előállított fluoreszcencia-görbével való összehasonlításával számítják ki. A különböző típusú minták (genomi DNS, plazmid DNS stb.) mindegyike saját standardgörbét igényel. Az abszorbancia-módszerekhez hasonlóan a számított koncentrációkat szükség szerint korrigálni kell a hígítási tényezővel.

Megfontolandó szempontok a fluoreszcens nukleinsavfesték kiválasztásakor a kvantitációhoz:

• Specifikusság: a különböző festékek optimalizálva vannak a dsDNS, ssDNS, RNS vagy kis RNS mérésére (pl., miRNS) kötődési mechanizmusuk és spektrális tulajdonságaik alapján - győződjön meg róla, hogy olyan fluoreszcens festéket választ, amelyik kötődik az Önt érdeklő célponthoz


• Szenzitivitás: a nagy érzékenységű fluoreszcens festékek lehetővé teszik, hogy kevesebb mintát használjon, vagy nagyon alacsony nukleinsav-koncentrációkat mérjen


• Dinamikai tartomány: egyes reagensekkel alacsony koncentrációban is kimutatható a nukleinsav, de magasabb koncentrációknál elveszíthetik linearitásukat; a használandó reagensnek alkalmasnak kell lennie a minták várható koncentrációtartományához


• Mintatérfogat: ha az Ön mintájának térfogata korlátozott, figyeljen a reagens vagy a készlet által megkövetelt mintatérfogatra


• Mintaformátum: egyes reagenseket és készleteket egyetlen csőben vagy küvettában történő mérésre optimalizáltak, míg másokat a nagyobb áteresztőképesség érdekében mikrolemezekben történő használatra szánnak


• Műszeres szűrők: ellenőrizze, hogy a fluorométere rendelkezik-e megfelelő gerjesztési és emissziós szűrőkkel a kiválasztott festékhez

DNS és RNS kvantitáció gélelektroforézissel /h2>

Mivel az agaróz gélelektroforézis elválasztja a DNS-t és az RNS-t az egyéb szennyeződésektől, ez a kvantitációs módszer kiküszöböli az abszorbancia-méréseken alapuló számításokkal kapcsolatos problémák egy részét. Az agarózgél-elektroforézis során az izolált DNS vagy RNS mintáját az agarózgél egy mélyedésébe töltik, amelyet elektromos térbe helyeznek. A negatív töltésű nukleinsav az anód felé vándorol, és a DNS- és RNS-fragmentumok méret és alak szerint szétválnak. Az agarózgél-elektroforézis további előnye, hogy lehetővé teszi a mintán belüli szennyező sávok és a nyírt szennyeződések láthatóvá tételét. A nukleinsav-koncentráció és -hozam meghatározható a minta sávjainak intenzitását ismert mennyiségű standardokkal való összehasonlításával. Mivel a DNS és az RNS 260 nm-en elnyeli a fényt, az intenzitás UV-transzilluminátorral mérhető. Nagyobb érzékenység érhető el, ha a nukleinsavmintákat és a standardokat nukleinsavfestékkel, például etídium-bromiddal vagy SYBR® zölddel jelöljük, és az intenzitást az adott festék meghatározott hullámhosszán mérjük. Ha a gélre töltött 2 µl hígítatlan DNS minta intenzitása megegyezik a 100 ng standardéval, akkor a minta koncentrációja 50 ng/µl (100 ng ÷ 2 µl). A kvantitatív meghatározáshoz használt standardoknak ugyanolyan méretűnek kell lenniük, mint az elemzett mintanukleinsav, és hasonlóan kell jelölni őket.

1. ábra. Az előkészített DNS agaróz gélelektroforézise. Az első négy sávban nagyobb nyírt vagy alacsony molekulatömegű nukleinsav-szennyeződések vannak a preparátumban.

Kvantitatív meghatározás valós idejű PCR-rel (qPCR)

A valós idejű PCR vagy kvantitatív PCR (qPCR) olyan fluorometriás szondákat használ, amelyek a PCR lágyulási fázisában kötődnek a cél-DNS-hez, vagy olyan fluoreszcens festékeket, amelyek a kettős szálú DNS-hez kötődnek. A fluoreszcencia detektáló modulokkal felszerelt speciális termikus ciklálók segítségével a fluoreszcenciajelet az amplifikáció során nyomon követik. A mért fluoreszcencia arányos a DNS teljes mennyiségével. Egy standard görbét használnak a cél-DNS mennyiségének meghatározására a vizsgálati mintákban. Lehetőség van digitális PCR-módszerek alkalmazására is a DNS standardgörbe nélküli mennyiségi meghatározására.

Az RNS-kvantitáció esetében a PCR-sablon a komplementer DNS (cDNS), amelyet az RNS reverz transzkripciójával nyernek.

A valós idejű PCR egyik legfontosabb előnye, hogy az amplifikálható nukleinsav mennyisége alapján specifikus célszekvenciákat tudnak számszerűsíteni. Ez előnyös lehet a genomi DNS mennyiségi meghatározásánál, ahol a mintában jelen lévő nyírt DNS és kisebb DNS- és RNS-fragmentumok mennyiségét figyelmen kívül hagyják a mérés során. További előnyök közé tartozik az inhibitorok kimutatása a reakcióelegyben, valamint a fluorometriás szondák eredendő specifitása.

2. ábra. A kvantitatív PCR-t (qPCR) SYBR Green fluoreszcens festék és a templát 10-szeres hígításával végeztük.

Következtetések

A megfelelő DNS- vagy RNS-kvantitációs módszert számos tényező alapján kell kiválasztani, beleértve a berendezések elérhetőségét, a tervezett downstream alkalmazást és az áteresztőképességet. Egyes kvantitációs módszerek további előnye, hogy lehetővé teszik a minta biológiai és kémiai tisztaságának meghatározását. Óvatosan kell eljárni az egyes módszerek hozamainak összehasonlításakor, mivel a szennyező anyagok jelenléte interferenciát okozhat a mérésekben, ami a hozam túl- vagy alulbecsléséhez vezethet.