Oligonukleotid tisztítás

• Módszerek
• Poliakrilamid gélelektroforézis
• Konklúzió

A DNS előállítása során minden egyes nukleotidot szekvenciálisan kapcsolnak a növekvő lánchoz a foszforamidit-kémia segítségével. Minden egyes kapcsolási ciklusban az oligonukleotidláncok kis százaléka nem hosszabbodik meg, így a teljes hosszúságú (n) és a csonka (n-1, n-2 stb.) szekvenciák ("shortmers") keveréke jön létre. Ezen kívül a hasítási és védtelenítési folyamat melléktermékeként kis molekulájú szennyeződések keletkeznek. 

A hasítás, védtelenítés és sótalanítás (a kis molekulájú szennyeződések eltávolítása) után további tisztítással a kívánt teljes hosszúságú szekvencia elválasztható a nemkívánatos shortmertől. Az adott technikához/alkalmazáshoz szükséges tisztaság (1. táblázat) a shortmers jelenléte által okozott potenciális problémáktól függ.

Az általános módosításokat, pl. biotint, Amino C2 dT-t stb. tartalmazó oligonukleotidok ezenkívül bármely alább ismertetett módszerrel tisztíthatók. A bonyolultabb festékszerkezeteket tartalmazó oligonukleotidok, pl. ROX™, TxRd (Sulforhodamine 101-X) stb. esetében a HPLC a megfelelő módszer; csak ez képes eltávolítani a szabad festéket, amely egyébként zavarná a tervezett technika/alkalmazás teljesítményét.

1. táblázat.Ajánlott tisztítási módszerek technikánként/alkalmazásonként.

Alkalmazás	Desalt	HPLC	PAGE	NGSO
Standard PCR &; RT-PCR	X	X	X
Szekvenáló primerek / próbák	X	X
qPCR próbák			X
Klónozás			X		X
Mikroelemek	X	X	X	X	X
siRNS szűrés	X<	X
Antisense			X	X
Bioengineering			X	X	X
Kristallográfia, NMR			X		X
in vivo Alkalmazás					X
NGS adapterek						X

Módszerek

Sótalanítás

Minden oligonukleotidot ingyenesen sótalanítunk.

A sótalanítás eltávolítja a kis molekulájú szennyeződéseket, pl. a foszfodiészter gerinc védtelenítéséből származó akrilnitrilt, amelyek a hasítás és a védtelenítés maradék melléktermékei. Számos technika/alkalmazás esetében, beleértve a PCR-t is, a sótalanítás elfogadható a ≤35 bázisú oligonukleotidok esetében, mivel a teljes hosszúságú szekvencia túlnyomó része túlsúlyban van a rövid szekvenciákhoz való hozzájárulással szemben (további információ&).nbsp;hozamszámítás). Az oligonukleotidok >35 bázisok további tisztítást igényelhetnek, például fordított fázisú patront (Cartridge).

A csak sótalanítással történő tisztítással nem biztosítható garantált tisztasági szint, mivel az eljárás nem távolítja el a rövidítőanyagokat.

Kazetta

A következő tisztasági szintet a fordított fázisú kazettán történő elválasztás biztosítja (1. ábra). Az elválasztás alapja a teljes hosszúságú szekvencia hidrofóbicitása közötti különbség (hidrofób 5'-DMT csoport) és a rövidszekvenciák (nem rendelkeznek 5'-DMT csoporttal) között. Míg a teljes hosszúságú szekvencia az oszlopon marad, a shortmers lemosódik. A patronon lévő 5'-DMT hasítása után a várt teljes hosszúságú szekvencia eluálódik és nyerhető vissza. Ezenkívül az 5'-végen bizonyos festékekkel módosított oligonukleotidok, pl. a cianin vagy a WellRED, a festékrész által biztosított fokozott hidrofobicitás miatt kompatibilisek a patrontisztítással.

Az oligonukleotid hosszának növekedésével az 5'-DMT csoportot tartalmazó shortmerek (a nem lefedett szekvenciák által létrehozott termék) aránya általában növekszik. Ezeket a nem kívánt szekvenciákat a patrontisztítás nem távolítja el, ezért hosszabb oligonukleotidok esetén nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC) vagy poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE) ajánlott.

A patrontisztítással nem biztosítható garantált tisztasági szint. A sokéves tapasztalat azonban azt mutatja, hogy a 65-80%-os teljes hosszúságú szekvencia (analitikus HPLC-n keresztül) általános.

RP-HPLC

A fordított fázisú nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (RP-HPLC) ugyanazon az elven működik, mint a fordított fázisú patron (1. ábra). A nagyobb felbontás azonban nagyobb tisztasági szintet tesz lehetővé. Az RP-HPLC hatékony tisztítási módszer a festékkel ellátott oligonukleotidok számára, mivel a festék saját hidrofobicitása kiválóan elválasztja a kívánt szekvenciát a festékhiányos, a shortmers és a deléciókkal rendelkező shortmers szekvenciáktól. Továbbá az RP-HPLC az oszlop kapacitása és felbontó tulajdonságai miatt a nagyszabású szintéziseknél is a választott módszer. A hidrofobicitáson alapuló felbontás azonban az oligonukleotid hosszával csökken. Ezért az RP-HPLC általában nem ajánlott oligonukleotidok >50 bázis tisztítására. Bár a hosszabb oligonukleotidok (akár 80 bázis, egyes esetekben ennél is hosszabb) tisztíthatók ezzel a módszerrel, a tisztaság és a hozam kedvezőtlenül befolyásolhatja a tisztaságot.

A standard RP-HPLC-vel jellemzően >85%-os tisztaságot érhetünk el a teljes hosszúságú szekvenciából (analitikus HPLC-n keresztül). A szekvencia jellegétől függően magasabb tisztasági szintek is elérhetők. Az RP-HPLC által biztosított tisztaság pontos jellegéről, valamint a kapcsolódó díjakról kérjük, érdeklődjön a helyi értékesítési vagy ügyfélszolgálati szakembernél.

1. ábra. Szétválasztás fordított fázissal: patron és HPLC. Mind a standard patronos, mind az RP-HPLC tisztítás a szekvencián lévő 5'-DMT-vel történik.
1) Az oszlopba való belépéskor a kívánt szekvencia hidrofób 5'-DMT-je adszorbeálódik a stacionárius fázisú gyantára.
2) Az 5'-DMT nélküli, és ezért a gyantával kölcsönhatásra képtelen shortmert a mobilfázis kimossa.
3) Az 5'-DMT lehasad, és a kívánt szekvencia eluálódik.

IE-HPLC

Az ion (pontosabban anion)-cserés nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (IE-HPLC) az oligonukleotid gerincében lévő töltött csoportok (foszfát) számán alapul. Az anioncserélő módszer egy só-gradiens mobilfázis használatát jelenti egy kvaterner ammónium állófázison (2. ábra). A felbontás kiváló a kisebb mennyiségek tisztításához. Az IE-HPLC-t azonban korlátozza a hossz, általában legfeljebb 40 bázis. A hosszabb oligonukleotidok alacsonyabb felbontást eredményeznek a teljes hosszúságú szekvencia és a rövidek között; és ezért alacsonyabb és kevésbé konzisztens tisztaságot eredményeznek.

Az IE-HPLC alkalmazásának elsődleges oka az RP-HPLC-vel szemben a jelentős másodlagos szerkezetű oligonukleotidok tisztítása, amelyek jellemzően magas GC-tartalmú szekvenciákban találhatók. Az IE-HPLC azért hatékony az ilyen oligonukleotidok esetében, mert a mobilfázis erősen lúgos pH-jú, ami megbontja a hidrogénkötést, és ezáltal a másodlagos szerkezetet. Ezt a technikát RP-HPLC követheti, hogy az elválasztási folyamatot egy második dimenzióval bővítsük.

A garantált százalékos teljes hosszúságú szekvenciákról érdeklődjön.

2. ábra. Szétválasztás IE-HPLC-vel. Az IE-HPLC tisztítás az 5'-DMT nélkül történik a szekvencián.
1) Az oszlopba való belépéskor a nyers keverék polianionos foszfátjai töltés-töltés kölcsönhatásokat képeznek a polikationos állófázisú gyantával.
2) A mobilfázis ionerősségének növekedésével a rövidítők kimosódnak.
3) A hosszabb, kívánt szekvencia még nagyobb ionerősségnél eluálódik utoljára.

PAGE

A poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE) denaturáló környezetet használ az oligonukleotidok szétválasztására a molekulatömeg, nem pedig a töltés alapján (3. ábra). Megfelelő körülmények között egyetlen bázissal eltérő oligonukleotidok is szétválaszthatók. Ez a kiváló méretfelbontás jellemzően az elérhető tisztítási módszerek közül a legmagasabb elérhető tisztasági szintet eredményezi. Az oligonukleotidok kivonásához szükséges bonyolult eljárás miatt a PAGE-kezelés minimális hozama alacsonyabb, mint más módszereké. Ez a technika akkor ajánlott, ha nagy tisztaságra van szükség, és ≥50 bázisú szekvenciák esetén.

A PAGE-kezeléssel jellemzően >95%-os teljes hosszúságú szekvencia tisztaság érhető el. Arról, hogy a PAGE pontosan milyen tisztaságot biztosít, valamint a kapcsolódó díjakról, kérjük, érdeklődjön a helyi értékesítési vagy ügyfélszolgálati szakembernél.

 

3. ábra. Szétválasztás a PAGE segítségével. A gélre elektromos mezőt alkalmaznak, amelynek hatására a polianionos oligonukleotid a pozitív töltésű anód felé halad. Mivel a töltés egyenletesen oszlik el a nyers keverékben, a különböző szekvenciák a molekulatömeg, azaz a hossz alapján különülnek el. A rövidebb szekvenciák gyorsabban, míg a hosszabb, kívánt szekvenciák lassabban haladnak.

Gélszűrés

A gélszűrés az in vivo kísérletekre szánt kisebb méretű oligonukleotidok esetében ajánlott (4. ábra). A gyártási helytől függően a foszforotioát oligonukleotidok (S-Oligók), amelyeket gyakran használnak in vivo antisense vizsgálatokhoz, gélszűrésen eshetnek át (kérjük, érdeklődjön a helyi értékesítési vagy ügyfélszolgálati szakembernél, hogy ez a kezelés elérhető-e az Ön földrajzi területén). Ez a tisztítás eltávolítja a szintézis, a hasítás és a leválasztás melléktermékeit (amelyeket a standard sótalanítás nem távolított el), valamint a tisztító oldószereket. Ezek a nyomokban keletkező melléktermékek, amelyek in vitro általában ártalmatlanok, in vivo citotoxikus hatásokhoz vezethetnek.

További in vivo lehetőségek állnak rendelkezésre a nagyobb mennyiségben előállított termékünkkel, az  iScale Oligos™-mal.

4. ábra. Szétválasztás gélszűréssel. A gélszűréses tisztítás a szekvencián lévő 5'-DMT nélkül történik.
1) Az oszlopba való belépéskor a kívánt szekvencia keveréke a különböző melléktermékekkel és oldószeres szennyeződésekkel együtt áthalad az állófázisú gyantán.
2) A mobilfázis áramlásával a kisebb szennyeződések belépnek a gél pórusaiba, ezáltal lelassul a mátrixon való áthaladásuk; a kívánt szekvencia nem lép be a gél pórusaiba, ezért a mátrixon keresztül haladva elsőként eluálódik.
3) A szennyeződések végül áthaladnak a gél pórusain és a mátrixon; és kimosódnak.

Újgenerációs szekvenáló oligók

A fenti hagyományos tisztítási módszerek hatékonyan eltávolítják a kismolekuláris szennyeződéseket, valamint a teljes hosszúságú szekvencia százalékos arányát a kívánatos szintre növelik. A rendkívül érzékeny technikák, például az újgenerációs szekvenálás (NGS) használatának folyamatos növekedése miatt a szennyeződések egy további típusa, a keresztszennyeződés is problémaként merült fel. A hagyományos tisztítási módszerek nem hatékonyak a keresztszennyező oligonukleotidok eltávolításában.

A keresztszennyeződések kis mennyiségei minden nagy áteresztőképességű oligonukleotidgyártó létesítményben realitásnak számítanak. Általában az ilyen kis mennyiségek nem gyakorolnak észrevehető hatást a hagyományos technikákra/alkalmazásokra, mint például a PCR. A legtöbb NGS platform azonban index (vonalkód) adapterekre támaszkodik a multiplexáláshoz. Ha kis mennyiségű rossz vonalkódot (keresztszennyeződés miatt) adnak a rossz szekvenálási célponthoz, a probléma az adatelemzési szakaszig nem észlelhető, ami idő- és pénzköltségessé teszi ezt a problémát.

Next-Gen Sequencing Oligos (NGSO) e probléma elkerülésére fejlesztették ki. Az NGSO-t saját tisztítási módszerekkel állítják elő, és minden olyan oligonukleotidhoz ajánlott, amelyet NGS-adapterként kívánnak használni.

Következtetés

Az oligonukleotidokat a tervezett felhasználástól függően különböző módszerekkel vagy módszerek kombinációjával célszerű tisztítani. Kezdetben tekintse meg 1. táblázat a technika/alkalmazás alapján ajánlott módszereket. Ha további segítségre van szüksége, kérjük, forduljon műszaki szolgáltatási csoportunkhoz a [email protected] címen.

.