Hogyan használható a proteináz K a vér DNS extrakciós alkalmazásokban?

DNS kettős spirál szál a vérmintában

Mi a proteináz K funkciója a vér DNS extrakciójában?

A proteináz K (Pro K) egy olyan enzim, amelyet általában DNS extrakciós protokollokban használnak a fehérjék lebontására, amelyek zavarhatják az olyan későbbi alkalmazásokat, mint a PCR, qPCR vagy szekvenálás.

A proteináz K különösen hasznos a sejtmagban a DNS-hez szorosan kötődő hisztonok eltávolításában. A hisztonokat nehéz eltávolítani a DNS extrakció során, és jelenlétük gátolhatja a PCR-amplifikációt vagy más downstream alkalmazásokat.

A vér DNS extrakciójában a proteináz K segíthet a sejt- és magmembránok lebontásában, így a DNS kiszabadul a sejtekből. 

Az emellett képes megemészteni a mintában jelen lévő különböző fehérjéket, beleértve a DNS-t lebontó nukleázokat is.

A Pro K használata a vér DNS extrakciójában növelheti a DNS hozamát és tisztaságát, így az alkalmasabbá válik a különböző molekuláris biológiai technikákhoz. 

Hogyan választjuk el a DNS-t a vértől?

A vér egy összetett biológiai minta, amely különböző összetevőket tartalmaz, többek között vörös- és fehérvérsejteket, vérlemezkéket, plazmát és DNS-t. A DNS vérből történő elválasztása általában több lépést foglal magában, többek között:

1.   A vörösvértestek (RBC) lízise: A vörösvértestek nagy koncentrációban tartalmaznak hemoglobint, amely zavarhatja a későbbi alkalmazásokat. Ezért a vér DNS-kinyerés első lépése az RBC-k lízise és a DNS-t tartalmazó sejtmagvú fehérvérsejtek (WBC-k) felszabadítása. 

2.    A WBC-k elkülönítése: Az RBC-k lízise után a keveréket centrifugáljuk, hogy a WBC-ket elválasszuk a vérminta többi komponensétől, például a plazmától és a vérlemezkéktől.

3.    A fehérjék emésztése: A WBC-k nagy koncentrációban tartalmaznak fehérjéket, amelyek gátolhatják a későbbi alkalmazásokat. E fehérjék eltávolítása érdekében proteináz K emésztési lépést végeznek, amely lebontja a fehérjéket és felszabadítja a DNS-t. 

4.  DNS extrakció: A fehérjeemésztést követően a DNS-t különböző módszerekkel, például fenol-kloroform extrakcióval, szilika alapú kötéssel vagy mágneses gyöngyökkel történő tisztítással vonják ki a mintából.

5.    DNS-kvantitatív meghatározás: Végül a kivont DNS-t spektrofotometriával vagy más módszerekkel mennyiségi meghatározásra kerül a koncentráció és a tisztaság meghatározása érdekében.

DNS kivonási protokoll vérből proteináz K használatával

A DNS vérből történő kivonásához a következő protokoll használható:

1.   Vegyünk 2 mL vérmintát, és adjunk hozzá 10-20 μL TE puffert, jól keverjük össze.

2.   Centrifugáljuk a mintát 2500 fordulat/perc fordulatszámon 20 percig

3.   Dobja el a felülúszót, és adjon 10-15 μL TE-puffert a pellethez, és óvatosan keverje össze.

4.   Centrifugálja a mintát 2 500 fordulat/perc fordulatszámon 15 percig. Dobja el a felülúszót, és adjon 20 μL proteináz K oldatot (kereskedelmi forgalomban kapható, azonnal használható) és 2 mL DNS extrakciós puffert a Falcon-csőbe.

5.    Inkubálja a mintát 56 ℃ és 60 ℃ közötti hőmérsékleten 1-2 órán keresztül, vagy amíg a pellet megfelelően fel nem oldódik.

6.   Most adjon 1-2 ml hideg izopropanolt és egy kis mennyiségű NaCl-t a Falcon-csőbe, és fordítsa meg a csövet egy ideig, hogy csapadékot kapjon.

7.   Centrifugáljuk a csövet 8000-10 000 fordulat/perc fordulatszámon, hogy a pellet leülepedjen az alján.

8.   Dobja el a felülúszót, adjon hozzá 1 ml etanolt, és centrifugálja 10 000 fordulat/perc fordulatszámon 1-2 percig.

9.   Dobja ki az etanolt, és szárítsa meg a pelletet a szárítóban.  

10. Adjunk TE-puffert (pH 8,0) a pellethez, és tegyük 37 ℃-os vízfürdőbe 2-3 órára 

Más Proteináz K információ

Az How Proteinase K can be used in Tissue Samples.

A különböző Proteináz K protokollok megismeréséhez látogasson el a Útmutató a proteináz K különböző eljárásokban való használatához

Hogyan találja meg a legjobb proteináz K szállítót, látogasson el a .Hogyan határozzuk meg a legjobb terméket és szállítót a proteináz K számára

Hogyan rendelhetünk nagy mennyiségben Proteináz K-t

A Proteináz K nagy kiszerelésű és egyedi kiszerelésű kiszerelései rendelkezésre állnak az Ön egyedi alkalmazásához. Töltse ki az űrlapot, hogy további információkat kapjon a kínálatunkról.

Hivatkozások

1. Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J. 1990. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28(3):495-503. https://doi.org/10.1128/jcm.28.3.495-503.1990

2. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. No. Ed. 2. Cold spring harbor laboratory press.

3. Walsh PS, Metzger DA, Higuchi R. 1991. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Bio Techniques. 10(4):506-513.