Downstream alkalmazások a genomi DNS tisztítása után
A következő táblázat összefoglalja a genomiális DNS több gyakori alkalmazási területére vonatkozó általános mennyiségi és tisztasági szempontokat.
Restrikciós enzimes emésztés
A genomi DNS restrikciós enzimekkel történő emésztését gyakran végzik a DNS későbbi manipulációra való előkészítése érdekében. A restrikciós enzimes emésztéshez általában 0,5 és 10 μg DNS-t használnak fel. A genomi DNS emésztése történhet ritka vágószerkezettel (pl, NotI), hogy nagy fragmentumok keletkezzenek, közönséges vágóval, hogy kis fragmentumok keletkezzenek, vagy restrikciós enzimek specifikus kombinációival.
Sók, szerves oldószerek és RNS zavarhatják a restrikciós enzimes emésztést vagy az emésztett fragmentumok elemzését.
Klónozás
A genomi DNS-darabkák plazmidba vagy más vektorba történő klónozásának klasszikus technikája egy vagy több restrikciós enzimmel történő emésztést, majd a darabkáknak a linearizált vektorba történő enzimatikus ligálását foglalja magában. A ritka vágóenzimekkel (pl. NotI) végzett emésztés nagy fragmentumokat eredményez a YAC-okba és BAC-okba történő klónozáshoz. A gyakori vágókkal végzett emésztés kisebb fragmentumokat eredményez, amelyek plazmidokba klónozhatók. Ha a cél véletlenszerű DNS-fragmentumok előállítása, ezt "shotgun" klónozásnak nevezzük. A genomi DNS-ben lévő ismétlődések és bővülések vizsgálatához nagyméretű inzertkönyvtárak előállítására lehet szükség a hatékony szekvencia-összeszereléshez. A szilícium-dioxid és anioncserélő közegek használata genomi DNS-előkészítéshez jellemzően nem eredményez 50 kb-os fragmentumokat. Ezért alapos megfontolásra van szükség az eljárások megtervezéséhez, amelyek magukban foglalhatják az emésztett genomi DNS géldugókból történő izolálását és méretfrakcionálását PFGE vagy Contour-clamped homogén elektromos mező (CHEF) rendszerekkel. A klónozás PCR-alapú technikákkal is elvégezhető. Ezek általában PCR-t használnak a genomiális DNS-töredékek felerősítésére a recipiens vektorokba történő ligálás előtt, amelyekbe specifikus pontmutációkat lehet bevezetni a funkció megváltoztatása érdekében.
A klónozott termékeket általában szekvenálásra, hibridizációs térképezésre, helyirányított mutagenezisre, valamint a génexpresszió transzkripciós és transzlációs kontrolljára használják. További felhasználási módok a specifikus fehérjék (címkékkel vagy anélkül) overexpressziója, valamint az ismert fehérjék szerkezetének és funkciójának tanulmányozására irányuló transzfekciós kísérletek.
Szekvenálás
A klónozás és a klónok megfelelő gazdaszervezetben történő szaporítása után a DNS szekvenálható. A szekvenálási reakciók általában nagyon robusztusak, és ritkán fordul elő, hogy legalább némi adatot nem generálnak. Bár a DNS-szekvencia összetételével kapcsolatban számos olyan probléma merül fel, amely befolyásolhatja a bázisok megnevezését, a reakciók teljes kudarca ritka.
A DNS minősége hatással lehet az általános teljesítményre. Gyakran egyszerűen a ciklusszekvenálási reakciók sablon DNS-sel való túlterhelése is negatív hatással lehet. Ezért javasoljuk, hogy a szekvenálás előtt pontosan határozza meg a DNS koncentrációját és tömegét.
Tipikusan, ha a szekvenálási eredmények rosszak, de a genomi DNS-amplifikáció a gél vizualizáció alapján sikeres volt, a konszenzus szerint a genomi DNS-ből származó szennyeződés és gátlás nem járul hozzá a rossz eredményekhez; a rossz eredmények a szekvenálási reakciókban használt primerek vagy egyéb reagensek számlájára írhatók.
Az illustra triplePrep Kit, amely képes egyetlen osztatlan mintából genomi DNS-t, teljes RNS-t és teljes denaturált fehérjét izolálni, vagy a DNeasy™ Kit használatával kapott tipikus szekvenálási eredményeket a 4.2. ábra mutatja. A magas Phred 20 pontszámok a genomiális DNS magas minőségét jelzik az olyan alkalmazásokhoz, mint a PCR és a szekvenálás.
PCR-amplifikáció
A PCR egy nagyon hatékony technika, amely a genomiális DNS fragmentumainak előkészítésére használható későbbi alkalmazásokhoz, például szekvenáláshoz, klónozáshoz és genotipizáláshoz. Ha a későbbi elemzést automatizálni kívánjuk, a PCR során jellemzően fluoreszcens festékeket használunk. A PCR-reakciókban használt humán genomiális DNS tipikus mennyisége 5 és 50 ng között mozog. Az onkológusok számára érdekes a szövetek és sejtek megfigyelése a daganat kialakulása során esetleg felerősödött vagy törölt, rákhoz kapcsolódó génekre vonatkozóan. Olyan módszereket fejlesztettek ki, amelyek lehetővé teszik a genomiális kópiaváltozások elfogulatlan azonosítását kiegyensúlyozott PCR-eljárással, amely figyelembe veszi a PCR-telítettséget és a minták szennyeződésbeli különbségeit a beteg és a normális sejtek összehasonlításakor (8). A Wang et al. által alkalmazott egycsöves eljárás lehetővé teszi a kiegyensúlyozott-PCR alkalmazását kis számú sejtből nyert genomiális DNS-re, ami releváns az array-CGH és a valós idejű PCR kvantitáció szempontjából. Ugyanez az eljárás alkalmazható a paraffinba ágyazott szövetekből nyert, mérsékelten lebomlott DNS esetében is. Lásd e fejezet korábbi részében az FFPE-szöveteknél.
Noha a PCR-amplifikációs reakciókhoz csak kis mennyiségű genomiális DNS szükséges, a szennyeződések gátolhatják a PCR-reakciókat. Ezek a szennyeződések közé tartozik a vérből származó genomi DNS-mintákban lévő hemoglobin vagy heparin, valamint a minta előkészítése során bevitt nyomokban lévő detergensek. A rossz minőségű DNS gyenge eredményekhez vezethet a PCR során.
Az endogén nukleázok által okozott DNS-bomlás minimalizálása érdekében a mintákat megfelelően kell gyűjteni és tárolni.
Az 4.3. ábrán látható kísérletben 11 kb-os amplikonokat sikerült felerősíteni, és a genomicPrep vagy a QIAamp™ segítségével tisztított genomiális DNS esetében nem tapasztaltunk gátló hatást. Az eredmények azt mutatják, hogy az illustra bacteria genomicPrep Mini Spin Kit segítségével izolált genomiális DNS nagy mérete alkalmassá teszi a hosszú PCR-re.
4.3. ábra. Egy 11 kb-os amplikon amplifikálása tisztított bakteriális genomiális DNS-ből. Reakciónként öt mikroliter eluált genomiális DNS-oldatot használtunk, ami 50-150 ng genomiális DNS-nek felel meg. A PCR-t követően az egyes reakciókból azonos térfogatokat 0,8%-os agarózgélen oldottuk fel etídium-bromiddal festett gélen. M = 1 kb molekulatömegű marker
Egy másik kísérletben a Genomic-tip 100/G vagy az illustra blood genomicPrep Midi Flow Kit segítségével emberi teljes vérből izolált genomiális DNS-mintákat értékeltünk ki valós idejű PCR-kísérletekben (4.4. ábra). Minden minta nagyon hasonló amplifikációs görbét mutatott, ami bizonyítja az izolált genomiális DNS reprodukálható minőségét és a valós idejű PCR alkalmazásokban való felhasználhatóságát.
4.4. ábraValós idejű PCR-amplifikáció 5 ml emberi teljes vérből kivont genomiális DNS-ből a Qiagen cég illustra genomicPrep Blood Midi Flow Kit és Genomic-tip 100/G segítségével. A genomi DNS izolálása a gyártó utasításai szerint történt. Száz ng genomiális DNS-t használtunk templátként. A 2. kromoszóma előre- és hátrafelé irányuló primereket használtunk.
Genotipizálás
A genotipizálás kifejezés olyan vizsgálatokra utal, amelyek feltárják a genetikai identitást és azt, hogy egyes tulajdonságok hogyan öröklődnek a szülőktől. A genomi DNS-ben bekövetkező változások korrelálhatnak az elveszett vagy csökkent fehérjefunkcióval, ami egy sejtes biomarker vagy fenotípus mérhető változásához vezet. A hatékony genotipizálási tesztek felhasználhatók a törvényszéki azonosság, a betegségek géntérképezése, a farmakogenomika, az evolúció és a populációdinamika tanulmányozása során. A genetikai variáció létezhet egybázisú változások, deléciók, inszerciók, ismétlődő elemek, átrendeződések és egyéb szekvencia-módosítások, például metiláció formájában.
A genotipizálás a legegyszerűbb tesztektől, ahol a DNS-ujjlenyomatot géleken végezték az RFLP tanulmányozására, a korszerűbb megközelítésekig fejlődött, amelyek nagymértékben párhuzamosított módszereket és automatizált kimutatási rendszereket használnak. Míg a szondakészleteket ki lehet fejleszteni egyetlen gén egyetlen bázismódosulásának kimutatására, a kutatókat gyakran érdekli számos SNP-változás kimutatása egyetlen genomban. A humán genomban számos gén és lokusz esetében jellemezték az egynukleotid variációt, amely több mint 1,5 millió SNP-t jelent. A nemzetközi HapMap projekt részletesebb, globális képet ad az SNP-kről és azok haplotípusokba való csoportosításáról. A módszerek fejlődésével lehetővé vált a genom-szerte végzett asszociációs vizsgálatok elvégzése, hogy feltárják a betegségre való hajlamossággal összefüggő egyes SNP-ket és haplotípusokat. Végső soron a mutációk hitelességét a genomi DNS-minták régióinak reszekvenálásával lehet ellenőrizni.
A genomi DNS-minták előkészítése kulcsfontosságú a különböző genotipizálási elemzések optimális eredményeinek eléréséhez. Az amplikonszondákon alapuló egyedi genotipizálási tesztek 10-50 ng genomiális DNS-t is felhasználhatnak, és szekvenciaspecifikus primerek és szondák készleteit igénylik. Az aCGH és SNP chipek több százezer allélváltozatot lefedő chipek állnak rendelkezésre. Egy-egy chip ára ~1000 USD, és képes a DNS-kópiaszám globális változásait és a szekvenciaspecifikus variációkat jelenteni, ugyanakkor nem fogyaszt többet 0,5-1 μg genomiális DNS-nél. Ha nagyon korlátozott mennyiségű DNS áll rendelkezésre, akkor a WGA segítségével elegendő kiindulási anyagot lehet biztosítani.
A genomi DNS genotipizálásra való felhasználhatóságát befolyásoló minőségi tényezők közé tartozik a minták degradációs állapota, a tisztasági szint, valamint az, hogy a minták exogén DNS-szel szennyezettek-e.
A félreértelmezés és a hamis pozitív eredmények elkerülése érdekében nagyon fontos az amplifikált minták keresztkontaminációjának csökkentése. Számos cikk jelent meg, amely a keresztszennyeződés minimalizálását célzó izolálási taktikákat és munkafolyamatokat írja le (9).
A genotipizálási eredményekre az alábbiakban egy példa látható. 10 személy vérmintáit Whatman FTA Elute mátrixra gyűjtöttük, és feldolgoztuk az UGT2B15*2 gén genotipizálási elemzéséhez. A mintákat négy ismétlésből álló sorozatokban futtattuk, és a két színezék, a HEX és a FAM fluoreszcenciájának függvényében ábrázoltuk. A 4.5. ábra egyértelműen megkülönbözteti a heterozigóta (wt/mut) és a homozigóta (mut/mut vagy wt/wt) mintákat. Az ilyen típusú adatok azt mutatják, hogy az FTA Elute nagyon tiszta DNS-templát eredményez, amely reprodukálható és kiválóan alkalmas a rendkívül érzékeny Scorpions ARMS technológiával való használatra.
4.5. ábra. A genotipizálást 10 különböző, FTA Elute-on tisztított DNS-mintából készült négy ismétléssel végeztük. A vizsgálatot Stratagene Mx3000P™ valós idejű PCR-berendezéssel végeztük. A Scorpions ARMS próbák az ARMS specificitását a Scorpions szondák jelátvitelével kombinálva használják az adatok előállításához. A fluoreszcencia méréseket a PCR előtt és után végeztük. Az NTC a templát nélküli kontrollra utal.
Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.
Még nem rendelkezik fiókkal?