L-Glutamin sejtkultúrában

L-glutamin egy gyakori szérummentes közepes kiegészítő, amelyet biogyártási alkalmazásokban, szövetmérnöki alkalmazásokban, speciális sejtkultúrákban, például hibridoma tenyésztésben, és más általános emlőssejtkultúra alkalmazásokban használnak. Mivel azonban az l-glutamin egy instabil esszenciális aminosav, a legtöbb kereskedelmi forgalomban kapható táptalaj úgy van összeállítva, hogy a szabad L-glutamin az alapképletben szerepel, vagy a felhasználáskor adják hozzá a folyékony készítményekhez.

A sejttenyésztéshez glutamint dipeptidként vagy fehérjehidrolizátumként kínálunk. Egyes, a biogyártásban használt védett táptalajokat dipeptid formában, például alanyl-l-glutaminnal és glicil-l-glutaminnal egészítenek ki L-glutaminnal. Az L-glutamin kevésbé jól meghatározott forrása a fehérjehidrolizátumok, különösen a gluténhidrolizátumok felhasználásából származik. A szérummentes vagy állati fehérjéktől mentes közegek igényeihez, például rekombináns kínai hörcsög petefészek sejtek (rCHO) tenyésztéséhez a búzaglutén gazdag peptidil-glutaminforrás.

Bővebben

• L-glutamin a sejtkultúrás rendszerekben
• Glutamin stabilitása sejttenyésztési médiumokban
• L-glutamin biokémiája

A klasszikus sejttenyésztő médiumok kiegészítéseként az L-glutamin koncentrációja a Ames' Medium 0,5 mM-tól a MCDB Media 131 10 mM-ig terjed. A biogyártási és szövettechnológiai alkalmazásokban ezekben a közegekben a tipikusabb koncentrációk 2 és 4 mM között vannak.

Az optimális L-glutamin koncentráció a DMEM/F12 Nutrient Mixture-ban 2 mM.5 mM, míg a szérummentes/fehérje mentes Hybridoma Medium-ban 2,7 mM. A DMEM esetében a GMEM, IMDM és H-Y közegben, az optimális koncentráció 4 mM. Az IMDM-et gyakran használják a saját hibridoma sejttenyésztő közegek kiindulási formulájaként; a hibridoma sejtek jobban növekednek a közegekben található átlagos L-glutamin koncentráció felett.

L-glutamin a sejttenyésztési rendszerekben

Kémiai instabilitása és a sejtek növekedése és működése szempontjából betöltött fontos szerepe miatt kritikus fontosságú, hogy az L-glutamin adagolása minden egyes egyedi sejttenyésztési folyamathoz optimalizált legyen. A glutamin molekuláris képlete C₅H₁₀N₂O₃, molekulatömege 146,15 g/mol, izoelektromos pontja 5,65, pka-értéke 2,17 és 9,13 között van. Ennek a kémiának, valamint az L-glutamin és alternatíváinak többféle adagolási formájának megértése szükséges ahhoz, hogy a kiegészítőt hatékonyan lehessen alkalmazni a sejtkultúrás alkalmazásokban.

1. ábra. L-glutamin kémiai szerkezete.

A glutamin támogatja a nagy energiaigényű, nagy mennyiségű fehérjét és nukleinsavat szintetizáló sejtek növekedését. Emellett alternatív energiaforrás a gyorsan osztódó sejtek és a glükózt nem hatékonyan felhasználó sejtek számára. A sejteknek szükségük van a glutaminban lévő nitrogénatomokra olyan molekulák felépítéséhez, mint a nukleotidok, aminosavak, aminosavak és vitaminok.

A glutamin a glutamát prekurzora, amely kulcsfontosságú aminosav, amelyet az alfa-ketosavak transzaminációjához használnak, hogy más alfa-aminosavakat képezzenek. Egy nitrogénatomot amidként, egy másik nitrogénatomot pedig aminként tartalmaz; emellett olyan mennyiségben szállít és juttat nitrogént a sejtekbe, amely nem olyan mérgező, mint a szabad ammónium.

Amikor a glükózszint alacsony, az energiaigény pedig magas, a sejtek képesek aminosavakat metabolizálni az energia érdekében. A glutamin amid nitrogénjét a NAD és NADP vitaminok, a purin nukleotidok, az UTP-ből származó CTP és az aszparagin szintézisében használják fel. Az eredetileg a glutaminban tárolt nitrogén felhasználható a pirimidinek szintéziséhez szükséges karbamil-foszfát előállítására is. A glutamin az egyik legkönnyebben hozzáférhető aminosav, amelyet energiaforrásként lehet felhasználni, és számos gyorsan osztódó sejttípus in vitro fő energiaforrása.

Glutamin stabilitása sejttenyésztési közegben

Amikor a glutamin aminosavmaradékként van jelen a fehérjékben vagy peptidekben, stabil. A feltételesen esszenciális aminosav egy R-csoportú amidot tartalmazó, szabadon oldódó semleges aminosav. Mivel instabil, folyékony közegben nem enzimatikus úton ammóniára és piroglutamátra (pirrolidonkarbonsav) bomolhat. Az L-glutamin időbeli lebomlása függ a pH-tól, a hőmérséklettől és a különböző anionok jelenlététől.

A glutamin-deaminálás, azaz az aminocsoportot eltávolító reakció savas és bázikus körülmények között egyaránt lejátszódik. A reakció lényegesen gyorsabban megy végbe foszfát vagy bikarbonát jelenlétében a közegben. A folyékony közegben rögzített foszfátkoncentráció mellett a deaminálódás sebessége nő, ahogy a pH 4,3-ról 10-re emelkedik.

L-glutamin biokémia

A nitrogént glutamáttá és glutaminná rögzítő reakciók energiaegyenértékeket, például NADH-t, NADPH-t vagy ATP-t fogyasztanak. A glutamát ammóniumból és alfa-ketoglutársavból, a trikarbonsavciklus (TCA) köztes termékéből szintetizálódik. Ehhez a szintézishez NADH vagy NADPH oxidációjára van szükség. A glutamát szintézisében részt vevő enzimek, a glutamát-dehidrogenáz (EC 1.4.1.4) és a glutamát-szintáz (EC 1.4.1.13), reverzibilisek.

Az ammónium, a sejtek által használt szervetlen nitrogénforrás, kezdetben a glutamát aminjaként vagy a glutamin amidjaként épül be a szerves nitrogénbe. Ez a két aminosav biztosítja az elsődleges nitrogénraktárakat a fehérjék, nukleinsavak és más nitrogéntartalmú vegyületek szintéziséhez. Az in vivo termelt ammónium, de in vitro nem, karbamiddá metabolizálható. Bizonyos in vitro körülmények között az ammónia ammóniumion formájában felhalmozódik az extracelluláris közegben.

A glutamin ammónium- és glutamátmolekulákból szintetizálódik. Ez a szintézis ATP formájában energiát fogyaszt. A szintézisért felelős enzim, a glutamin-szintetáz (EC 6.3.1.2) erősen szabályozott, hogy a glutamin termelést a sejt szükségleteihez igazítsa. A glutamin glutamáttá és ammóniummá történő katabolizmusát a mitokondriális enzimek, a glutaminázok (EC 3.5.1.2) közvetítik.