Glükóz a sejtkultúrában

A glükóz jelentősége és felhasználása szérummentes eukarióta, többek között hibridoma és kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtkultúrákban

Glükóz, egy szérummentes médiumkiegészítő, amely hasznos a biogyártásban; szövetszerkesztés és speciális médiumok:

A glükóz egy oldható hexózcukor, amelyet minden sejttenyésztési közeghez hozzáadnak, beleértve az Ames' Mediumot; Basal Medium Eagle (BME); BGJb Medium Fitton-Jackson Modification; Click's Medium; CMRL-1066 Medium; Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM); DMEM/Ham's Nutrient Mixture F-12 (50:50); F-12 Coon's Modification; Fischer's Medium; H-Y Medium (Hybri-Max^®); Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM); McCoy's 5A Modified Medium; MCDB Media; Medium 199; Minimum Essential Medium Eagle (EMEM); NCTC Medium; Nutrient Mixture, Ham's F-10; Nutrient Mixture, Ham's F-12; Nutrient Mixture Ham's F-12 Kaighn's Modification (F12K); RPMI-1640; Serum-Free/Protein Free Hybridoma Medium; Waymouth Medium MB; Williams Medium E és különböző szabadalmaztatott médiumok. Az L-15 médium glükóz helyett galaktózt tartalmaz.

A sejttenyésztési készítményekben a glükóz mennyisége 1 g/l (5,5 mM) és 10 g/l (55 mM) között változik. Sok klasszikus táptalajt körülbelül 5,5 mM D-glükózzal egészítenek ki, ami megközelíti a normál vércukorszintet in vivo. Ezek a közegek a következők: Ames' Medium; Basal Medium Eagle (BME); Click's Medium; CMRL-1066 Medium; Fischer's Medium; Medium 199; Minimum Essential Medium Eagle (EMEM); NCTC Medium; és Swim's S-77 Medium. Az MCDB médiumsorozat 3,9 és 10 mM közötti glükózt tartalmaz. Az F-12 Coon's Modification 10 mM, az RPMI-1640 és a Williams Medium E pedig 11 mM glükózt tartalmaz.

A 10 mM-ot megközelítő glükózkoncentrációk prediabetikus szintnek számítanak. A 10 mM feletti glükózkoncentrációk a sejtkultúrás rendszerben a diabéteszes állapotnak felelnek meg. Ez azért fontos, mert ugyanazok a folyamatok, amelyek a sejteket és molekulákat in vivo befolyásolhatják in vitro. A sejtek lényegében diabéteszes körülmények között történő tenyésztésének következménye, hogy a sejteket és a sejttermékeket a glikáció és a glioxidáció folyamatai módosítják. Ezek a folyamatok a sejtkultúrákban előállított terápiás fehérjék poszt-transzlációs másodlagos módosításait okozzák.

A biogyártásban és a szövetmérnöki tevékenységben használt védett médiumok tervezéséhez használt számos fontos médium diabetikus szintű glükóz-kiegészítést tartalmaz. A DMEM/Ham's Nutrient Mixture F-12 (50:50) 17,5 mM D-glükózt tartalmaz; a DMEM (Hi), a GMEM és az IMDM mind 25 mM D-glükóz-szintet tartalmaz; a H-Y médium (Hybri-Max^®) és a Serummentes/Proteinmentes Hybridoma Medium pedig 22,6, illetve 28,9 mM D-glükózt. Ezek a glükózszintek speciális formulázási stratégiákat igényelnek a sejtek és a sejttermékek glükóz által közvetített oxidatív és karbonil stressztől való védelme érdekében. A D-glükóz, mint sejttenyésztési adalékanyag részletesebb tárgyalása érdekében látogasson el a Média Szakértőnkhöz^®.

A glükóz elsődleges funkciói a sejtkultúrás rendszerekben:

A heterotróf állati sejtek az energiát kapcsolt oxidációs-redukciós reakciókból nyerik. A glükóz a heterotrófok elsődleges üzemanyaga. A glükózból nyert energia az ATP-ben vagy más nukleotid-trifoszfátokban lévő nagy energiájú foszfátkötések formájában, valamint a NADP és NAD koenzimekhez kapcsolódó, energiában gazdag hidrogénatomok formájában tárolódik. Az ezen nagy energiájú köztes vegyületek előállításában és felhasználásában részt vevő anyagcsere-utak a

• citoplazmatikus glikolitikus út
• citoplazmatikus pentóz-foszfát sönt, PPP
• citoplazmatikus:Mitokondriális aszpartát:malát shuttle
• cytoplam:mitokondriális glicerin:foszfát shuttle
• mitokondriális trikarbonsavciklus, TCA
• mitokondriális elektrontranszportlánc

A környezeti tényezőkre reagálva ezen útvonalak finom egyensúlyától függ a hatékony energiaanyagcsere és a csökkentett sejtkörnyezet fenntartása. Fontos megérteni, hogy ezek az útvonalak hogyan és mikor működnek a sejt kompartmentjein belül, ahogyan az a változó környezeti körülményekre reagál.

Cellbejutás:

A glükóz nem képes a sejtmembránon keresztül diffundálni a transzporterfehérjék segítsége nélkül. Legalább 13 különböző funkciójú hexóztranszporter fehérjét azonosítottak. Egyes hexóztranszporterek lehetővé teszik a glükóz passzív áramlását a magas koncentrációból az alacsonyba anélkül, hogy a sejt energiaráfordítást igényelne. Azok, amelyek a glükózt a koncentrációgradiens ellenében mozgatják, energiát fogyasztanak, általában ATP formájában. In vitro, a külső glükózkoncentráció meghaladja az intracelluláris koncentrációt. Ilyen körülmények között a passzív hexóztranszporterek fontosak. A Glut-2, Glut-3 és Glut-5 transzporterek elsősorban a specializált szövetekben találhatók. A Glut-1 és a Glut-4 a sejttípusok széles skáláján megtalálható. Sok sejttípusban egynél többféle hexóztranszporter található.

Cellavédelem:

A sejt belsejében a glükózt elsősorban a hexokináz foszforilálja glükóz-6-foszfáttá (G6P). A G6P átalakulhat glükóz-1-foszfáttá (G1P), vagy beléphet a glikolitikus vagy pentóz-foszfát útvonalba. A glikolitikus és a pentóz-foszfát útvonalon (PPP) metabolizálódó G6P mennyiségét a foszfofruktokináz (PFK) és a glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz (G6PD) relatív aktivitása szabályozza. A PFK és a G6PD aktivitás egyensúlyát számos szinten szabályozzák.

A glükóz biztosítja a szükséges redukáló erőt az oxidatív fajok semlegesítéséhez (oxidatív stressz), amelyek in vivo és in vitro képződnek. A citoplazmatikus NADP indukálja a G6PD-t, hogy a G6P-t 6-foszfo-gamma-laktonná alakítsa át, és elindítja a PPP-t. Ezzel egyidejűleg a G6PD a NADP-t NADPH-vá redukálja. A NADPH a glutation és a tioredoxin elsődleges reduktánsa, két nagyon fontos molekula az oxidatív stressz kezelésében. Ha egy sejt nem képes fenntartani a redukált intracelluláris környezetet, akkor apoptózisba lép.

A glükóz metabolizmusa a pentóz-foszfát út oxidatív ágán keresztül biztosítja a NADPH pool fenntartásához szükséges redukáló erőt. Meg kell jegyezni, hogy a G6PD metabolizálja a G6P-t, mielőtt bármilyen glükóz-metabolit keletkezne, amely részt vehet az energia-anyagcserében. A sejtek in vitro oxidatív stressznek vannak kitéve, és túlélési és növekedési képességüket valószínűleg jelentősen befolyásolja az a képességük, hogy a PPP-n keresztül NADPH-t termeljenek.

Cell-energia:

Amikor a glükóz szintje elegendő, metabolitjai a PPP és a glikolitikus útvonalakon keresztül gliceraldehid-3-foszfátot (G3P) képeznek. A glikolízisből származó, végül ATP-ként tárolt energia a gliceraldehid-3-foszfát szintjén és az alatt lejátszódó reakciókból származik. A piruvátnak és a NAD-vitaminnak különböző szerepe van a redukáló ekvivalensek mitokondriális rendszerekbe történő átvitelében. A NAD a TCA-ciklust megkerülő transzfereken keresztül juttatja el a redukáló ekvivalenseket az elektrontranszport rendszerbe, a piruvát pedig a TCA-cikluson keresztül juttatja el a redukáló ekvivalenseket.

NAD:NADH:

A G3P glikolízisét a gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (G3PD) indítja el piruváttá. Ez a többlépcsős folyamat citoplazmatikus ATP-t és NADH-t termel. A G3PD reakció az oxidált citoplazmatikus NAD elérhetőségétől függ. A NAD nem mozog a mitokondrium és a citoplazma között, és a citoplazmatikus NAD mennyisége korlátozott. Magas glükóz mellett a gliceraldehid-3-foszfát felhalmozódik a sejtben, hacsak a citoplazmatikus NADH nem oxidálódik folyamatosan újra. A sejtek a citoplazmatikus NADH-t három útvonal kombinációjával oxidálják, az aszpartát:malát transzferrel, a glicerin:foszfát transzferrel és a piruvát laktáttá történő átalakítása során.

Aszpartát:malát shuttle:

Az aszpartát:malát shuttle a G3P oxidációja során keletkező citoplazmatikus NADH redukáló ekvivalenseit szállítja malát formájában a mitokondrium mátrixába. Eközben regenerálja a NAD-ot, amelyet a G3PD felhasználhat a glikolízis fenntartásához. Ezt a rendszert részben a glutamin hajtja.

Glicerin-foszfát transzfer:

A sejtek a glicerin-foszfát transzfer segítségével regenerálhatják a citoplazmatikus NAD-ot. Ez a transzfer a citoplazmatikus (1.1.1.1.8) és a mitokondriális glicerin-foszfát dehidrogenázok (EC 1.1.99.5) aktivitásától függ. Ezek az enzimek a mitokondriumon belül és kívül átalakítják a dihidroxiaceton-foszfátot és a glicerin-3-foszfátot, és hatékonyan továbbítják a redukáló egyenértékeket a citoplazmatikus NADH-ból a belső és külső mitokondriális membránok között elhelyezkedő dehidrogenáz-komplexbe. Sok transzformált sejtből hiányzik a citoplazmatikus glicerin-foszfát-dehidrogenáz. Ezt a rendszert nem hajtják meg az aminosavak.

Citoplazmatikus tejsav-dehidrogenáz

A sejt tejsav-dehidrogenáz (LDH) képes újraoxidálni a citoplazmatikus NADH-t a piruvát tejsavvá alakításával. Ez egy pazarló folyamat, amely metabolikus zsákutcába vezet. Az aszpartát:malát vagy gyilcerin:foszfát transzferrel nem oxidált NADH-t az LDH metabolizálja. A tejsav felhalmozódása a sejtkultúrás rendszerekben annak bizonyítéka, hogy a siklók nem képesek újraoxidálni az összes NAD-ot, amely a G3P-katabolizmus fenntartásához szükséges. Nagy mennyiségben a tejsav toxikussá válik a sejtek számára.

Piruvát:

A glükóz potenciális energiaforrás a sejtek számára, amikor metabolitja, a piruvát bejut a mitokondriumba, és acetil-CoA-vá dekarboxilálódik. A mitokondriális acetil-CoA citráttá alakul, amely vagy a trikarbonsavciklust (TCA) táplálja, vagy a mitokondriumból a citoplazmába távozik. Ha a citrát belép a TCA-ciklusba, akkor tovább metabolizálódhat ATP és mitokodriális NADH előállítására. A mitokondriális NADH a redukáló ekvivalensek szállító molekulája a légzési láncba. A legtöbb, de nem az összes ATP a sejt mitokondriumaiban képződik az oxidatív foszforiláció folyamata során. A citrát a trikarbonsav-transzportrendszeren keresztül kiléphet a mitokondriumból, és acetilcsoportjait zsírsavak vagy izoprenoidok szintéziséhez adhatja. A piruvát nem léphet be a mitokondriumba. A tejsav-dehidrogenáz segítségével tejsavvá redukálódhat. Ezt a reakciót az hajtja, amikor a sejtnek a glikolízis fenntartásához szükséges NADH-t NAD-dá kell oxidálnia, hogy azt szubsztrátként használhassa. A piruvát hidrogén-peroxiddal reagálva vizet, szén-dioxidot és ecetsavat képez. Ez a nem enzimatikus reakció segít a sejtnek megvédeni magát az oxidatív köztitermékektől.

A D-Glükóz kémiai jellemzői, amelyek hasznos szérummentes közegkiegészítővé teszik:

D-Glükóz:

Molekuláris képlet: C₆H₁₂O₆

Molekulatömeg: 180,16

A glükóz egy hat szénatomos aldehidcukor, amely különböző sztereoizomer formákban és lineáris vagy ciklizált molekulaként létezik. A D-glükóz az állati sejtek által használt természetes forma. A D a C5 szénatom körüli aszimmetriára utal. A glükóz vízben oldva szinte kizárólag ciklikus formában létezik. Az α és β jelölések a C1 szénatom körüli aszimmetriára utalnak, amikor a glükóz ciklikus formában van. Az α- és β- formák egymásba fordulhatnak. A folyamatot mutarotációnak nevezzük.

A glükóz nagyon jól oldódik és kémiailag stabil a normál fiziológiás oldatokban és közegekben. A glükóz azonban redukáló cukor, amely részt vesz a Schiff-bázisok képződésében és az Amadori átrendeződésekben, amelyek fehérjék glikációját és karbonil stresszt okoznak a sejtkultúrákban. A glükóz glikációt és karbonil stresszt elősegítő képessége fontos szerepet játszik a biológiailag előállított molekulák, különösen a fehérjék másodlagos módosításaiban.

Glükóztermékek, amelyek fokozzák a hibridoma, a kínai hörcsög petefészek (CHO) és más emlős eukarióta sejtek növekedését szérummentes kultúrákban.

A sejtkultúra-média szakértőnk^® mélyrehatóan tárgyalja ezt és más szérum- és fehérjementes médium-kiegészítőket. A Media Expert^® további szakaszokat tartalmaz a nyersanyagokról, az összetevők felhasználására vonatkozó ajánlásokról, a formulázási stratégiákról és a hivatkozásokról. Bármikor, amikor kérdései vagy problémái vannak az eukarióta emlős sejttenyésztő rendszerével kapcsolatban, látogasson el a Media Expert^® -re, ahol hasznos útmutatást kaphat.