Western Blotting membránok eltávolítása és újbóli lemosása

A western blotting a fehérjék működésének és lokalizációjának vizsgálatára gyakran használt technika. Jellemzően a fehérjemintákat SDS-PAGE segítségével választják el, majd egy nitrocellulóz vagy PVDF membránra viszik át, amelyet aztán specifikus antitestekkel vizsgálnak meg. A nukleinsav-alapú technológiákkal ellentétben, amelyek lehetővé teszik a Southern és Northern blotok újrafelhasználását, a Western blotokat nehéz újrafelhasználni.

A Western blotok lecsupaszítása és újbóli vizsgálata számos előnnyel jár:

1. A drága vagy csak korlátozott mennyiségben rendelkezésre álló minták megőrzése;
2. Egy adott blot elemzése több különböző antitest felhasználásával, pl. altípus- vagy izoforma-specifikus antitestek;
3. A rendellenes eredmények újraelemzése és megerősítése ugyanazzal vagy egy másik antitesttel;
4. A rossz antitesttel történő inkubáció hibáinak korrigálása;
5. Költségmegtakarítás a reagensekben és az időben ugyanazon blot újrafelhasználásával.

A Western blotokról történő antitest-eltávolításra több protokollt is közzétettek, köztük olyanokat, amelyek alacsony pH-t, hőt és detergenseket, valamint kaotróp szereket használnak. Az alábbiakban három ajánlott protokollt mutatunk be. Az első bármely kemilumineszcens szubsztrátrendszerhez alkalmazható, és detergens és hő kombinációját használja az antitestek felszabadítására. A második általában olyan alkalmazásoknál használatos, ahol az antitesteket el kell választani az antigéntől, és alacsony pH-t alkalmaz az antitest szerkezetének olyan módon történő megváltoztatására, hogy a kötőhely már nem aktív.

A harmadik protokoll a ReBlot™ Plus Western Blot Recycling Kit-et alkalmazza, amelyet kifejezetten a Western blot membránokról történő antitestek eltávolítására fejlesztettek ki. Ennek a megközelítésnek az előnyei a következők

• A β-merkaptoetanollal kapcsolatos szagok elkerülése.
• Szobahőmérsékleten történő feldolgozás.
• Az antitestek eltávolítása 15 perc alatt.

Ezek a módszerek egyike sem távolítja el a kromogén detektáló rendszerekből keletkező színes csapadékokat (pl, BCIP, 4CN, DAB és TMB). Mindazonáltal a blotot egy másik, más célfehérjére specifikus antitesttel is lehet elemezni.

Az ilyen protokollokat általában csak kvalitatív célokra szabad használni, kivéve, ha megállapítást nyert, hogy a strippelés nem befolyásolja kvantitatív módon az adott antigént. A módszertől és a használt membrán típusától függően sok antigén legalább 5 strippelési ciklust kibír. Figyelembe kell azonban venni, hogy minden egyes strippelési ciklus során a membránban immobilizált fehérjék kis részei eltávolításra kerülnek. Ha több antigént kell egymás után detektálni, ajánlott olyan antigénekkel kezdeni, amelyek várhatóan kisebb mennyiségben fordulnak elő, vagy kisebb jelet adnak.

A következőkben néhány további ajánlást találunk, ha egy vagy több antitest-eltávolítási körrel végzett Western blot kísérletet tervezünk.

• A PVDF-membránok robusztusabbak, mint a nitrocellulóz, ezért minden olyan protokollhoz ajánljuk, amely antitest-sztrippelést tartalmaz.
• A PVDF-membránok szárítása közvetlenül az SDS-PAGE gélről való átvitel után javítja a fehérjék kötődését a membránhoz, és különösen ajánlott, ha többszörös strippelést tervezünk. A száraz PVDF-membránokat az immundetektálás első fordulója előtt alkohollal újra kell nedvesíteni.
• Az alacsony abundanciájú antigéneket kell először detektálni.
• Az alacsony affinitású antitesteket a nagy affinitású antitestek előtt használja.
• Fontos: Bár a PVDF folt szárítása közvetlenül az átvitel után ajánlott, a foltot nem szabad hagyni megszáradni az immunodetektálás két fordulója között. A maradék antitestmolekulák tartósan kötődni fognak a membránhoz, ha hagyjuk megszáradni.

1. protokoll Hővel és mosószerrel történő eltávolítás

Az 1. protokoll szerinti eltávolítás hővel és tisztítószerrel

Szükséges berendezések és megoldások

• Szokásos blot vagy blotcsíkok, nitrocellulóz vagy PVDF membránon.
• Blokkoló oldatok.
• Strippelő oldat: 100 mM 2-merkaptoetanol (M3148), 2% (w/v) SDS (L3771), 62.5 mM Tris-HCl (T6666), pH 6,7.
• Foszfátpufferes sóoldat (PBS): 10 mM nátrium-foszfát, pH 7,2, 0,9% (w/v) NaCl.
• Mély tálca, elég nagy a membrán befogadásához.
• Pozitív és negatív strippelő kontrollok.

Eljárás

1. A füstelvezetőben helyezze a foltot a sztrippelőoldatba, és inkubálja kevergetés mellett 30 percig 50 °C-on.
2. Tegye a blotot pufferbe, és keverje 10 percig. Ismételje meg friss pufferrel.
3. Választható:  Ismételje meg a kezdeti kimutatási protokollt (kihagyva az elsődleges antitest lépést), hogy meggyőződjön
4. arról, hogy az antitestek inaktiválódtak vagy lecsíkozódtak a membránról.
5. Tegye a blotot pufferbe, és 10 percig keverje.
6. Folytassa a blokkolási lépést az immunodetektálás következő fordulójához.

Protokoll 2. Eltávolítás alacsony pH-val

Szükséges berendezések és oldatok

• Szokásos blot vagy blotcsíkok, nitrocellulóz vagy PVDF membránon.
• Blokkoló oldatok.
• Stripping oldat: 25 mM glicin-HCl (G2879), pH 2,1% (w/v) SDS (L3771).
• Foszfát pufferelt sóoldat (PBS): 10 mM nátrium-foszfát, pH 7,2, 0,9% (w/v) NaCl.
• Mély tálca, elég nagy a membrán befogadásához.
• Pozitív és negatív strippelő kontrollok.

Eljárás

1. Tegye a foltot a strippelőoldatba, és 30 percig keverje.
2. Tegye a blotot pufferoldatba, és keverje 10 percig. Ismételje meg friss pufferrel.
3. Folytassa a blokkolási lépést az immundetektálás következő fordulójához.

Protokoll 3. strippelés a ReBlot™ Plus Western Blot Recycling Kit segítségével

A Re-Blot Plus enyhe antitest-eltávolító oldat jó eredményeket ad mind nitrocellulóz-, mind PVDF-membránon. A Re-Blot Plus Strong Antibody Stripping Solution azonban jobban teljesít, ha nagy jelű membránokat kell eltávolítani, vagy ha a Re-Blot Plus Mild kezelés nem elegendő.

Szükséges berendezések és megoldások

• Szokásos blot vagy blotcsíkok, nitrocellulóz vagy PVDF membránon.
• Blokkoló oldatok.
• Műanyagfólia azon blotok tárolásához, amelyeket nem kell azonnal újra előbélyegezni.
• ReBlot™ Plus Kit
• Desztillált víz, a reagensek hígításához.
• Mély tálca, amely elég nagy a membrán befogadásához.
• Pozitív és negatív sztrippelési kontrollok.

Eljárás

Figyelem! Az újrafelhasználásra szánt blotokat vagy egyedi csíkokat az első használat után azonnal elő kell készíteni a strippeléshez. Ha a strippelést nem lehet azonnal elvégezni, a membránokat műanyag fóliába lehet csomagolni és 4°C-on PBS-ben nedvesen tárolni. NE TÁROLJUK SZÁRÍTOTTAN a fóliacsíkokat.

1. Töltsön meg egy műanyag tálcát megfelelő mennyiségű 1X antitest-csíkoló oldattal (a készletben található).
2. Egy csipesz vagy csipesz segítségével merítse a foltot vagy a foltcsíkokat a csíkolóoldatba. Inkubáljon óvatos keverés mellett 15 percig szobahőmérsékleten.
3. Töltsön meg egy tiszta műanyag tálcát azonos mennyiségű blokkoló pufferrel. A hagyományos blokkoló pufferek, mint például 20 mM Tris HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 0,1% TweenR-20; 5% száraz tej vagy hasonló megfelelő.
4. Mossuk a blotokat kétszer 5 percig egyenként blokkoló pufferrel.
5. A blot most már készen áll az antitestekkel való újbóli próbára.

Hivatkozások

1. Lioubin MN, Myles GM, Carlberg K, Bowtell D, Rohrschneider LR. 1994. Shc, Grb2, Sos1, and a 150-kilodalton tyrosine-phosphorylated protein form complexes with Fms in hematopoietic cells.. Mol. Cell. Biol.. 14(9):5682-5691. https://doi.org/10.1128/mcb.14.9.5682

2. Legocki RP, Verma DPS. 1981. Multiple immunoreplica technique: Screening for specific proteins with a series of different antibodies using one polyacrylamide gel. Analytical Biochemistry. 111(2):385-392. https://doi.org/10.1016/0003-2697(81)90577-7

3. Harlow E, Lane D. 1988. A Laboratory Manual. 579. New York: Cold Spring Harbor Laboratory.

4. Kaufmann SH, Ewing CM, Shaper JH. 1987. The erasable Western blot. Analytical Biochemistry. 161(1):89-95. https://doi.org/10.1016/0003-2697(87)90656-7

5. Yeung Y, Stanley ER. 2009. A solution for stripping antibodies from polyvinylidene fluoride immunoblots for multiple reprobing. Analytical Biochemistry. 389(1):89-91. https://doi.org/10.1016/j.ab.2009.03.017