Immunodetektálás BCIP/NBT szubsztrát használatával

Az 5-brom-4-klór-3-indolil-foszfát (BCIP)/nitrokék tetrazólium (NBT) ideális oldhatatlan szubsztrát az alkalikus foszfatázzal való használatra. Ez a rendszer kék-lila terméket eredményez. Az intenzív szín vizuálisan is megfigyelhető, nagyon stabil, és nem halványul el fény hatására.

A következő Western blot inkubációs és mosási lépéseket szobahőmérsékleten, orbitális rázó platformon végezzük. Az elsődleges ellenanyagot a másodlagos ellenanyagot befogadó állat 1%-os normál szérumában hígítjuk TBS-ben. Más, nem zavaró fehérjék (pl. BSA, hemoglobin, ovalbumin) helyettesíthetők. PVDF-membrán használata esetén a körülmények optimalizálást igényelhetnek.

1. A Western blot elsődleges ellenanyaggal történő inkubálása után mossa a nitrocellulózmembránt négyszer 5 percig, egyenként elegendő TBS/TWEEN-nel.
   
   
   
2. Inkubálja a membránt 1 órán át megfelelő hígítású alkalikus foszfatáz-szekunder antitest konjugátumban. (1:30 000 a feljavított alkalikus foszfatáz konjugátumok esetében) TBS/TWEEN-ben.
   
   
   
3. Mossuk a membránt 4 alkalommal TBS-ben, egyenként 5 percig.
   
   
   
4. Készítsen SIGMAFAST™ BCIP/NBT tablettákat (Termékszám. B5655) a csomagoláson található utasításoknak megfelelően. Folyékony BCIP/NBT szubsztrátum is használható (terméksz. B1911).
   
   
5. Inkubálja a membránt a szubsztrátkeverékben 10-30 percig a színfejlődésig.
   
   
   
6. Állítsa le a reakciót a membrán többszöri desztillált vízben történő mosásával.
   
   
   
7. Szárítsa meg a membránt levegőn, és tárolja sötétben, műanyag tokban.

Megjegyzés: A száraz membrán 2-8 °C-on, két lap törlőpapír között, műanyag tokban tárolható.