FLAG fúziós fehérjék immunprecipitációja monoklonális antitest-affinitású gélek segítségével

• Mi az a FLAG peptidcímke, és hogyan használják a fehérjék izolálására és tisztítására?
• Immunoprecipitáció technikai áttekintése
<.a href="#protokoll">A FLAG fúziós fehérjék immunprecipitációjának (IP) protokollja M2 affinitási gélek használatával
• Kis mennyiségű FLAG fúziós fehérjék tisztítása

Az immunprecipitáció (IP) a FLAG^® peptid taggel fuzionált fehérjék hatékony, nagy hozamú izolálására és tisztítására használható. Az IP-t az ANTI-FLAG^® M2 affinitási géllel végezzük, amely egy agarózgyantához kovalensen kötött, rendkívül specifikus monoklonális antitest. Az affinitásgyanta lehetővé teszi a FLAG^®-jelölésű fehérjék hatékony kötését előzetes lépések és kalibrációk nélkül. Az immunprecipitált FLAG^®-jelzett fúziós fehérjék hatékonyan eluálhatók a gyantából savas körülmények között vagy FLAG^® peptiddel való versengéssel. Az immunprecipitált fehérjék ezután elemezhetők méretük, poszttranszlációs módosulásaik és gél kölcsönhatásaik tekintetében elektroforézis során, valamint aktivitásvizsgálatokkal .

Mi az a FLAG peptidcímke, és hogyan használják a fehérjék izolálására és tisztítására?

A FLAG^® peptidek a fehérjék kimutatására és tisztítására használt markerpeptidek. A FLAG^® tag peptid nyolc aminosavból (DYKDDDDK) áll, amelyek maximalizálják az immunogenitást, így a FLAG<^® tag ellen termelt nagy affinitású monoklonális antitesteksup>® szekvencia ellen termelt monoklonális antigonoklonális monoklónokat lehet használni a FLAG^® peptidet tartalmazó fehérjék kimutatására és izolálására. Rekombináns technikával FLAG^®marker peptideket lehet hozzáadni a fehérje N-terminusához, C-terminusához vagy az N-terminushoz, amelyet egy metionin-maradék előz meg (Met-FLAG^®), valamint belső pozíciókban.br />

Immunoprecipitáció technikai áttekintése

Az immunprecipitáció a következő lépésekből és köztes termékekből áll: sejtlízis, specifikus antigén kötődése egy antitesthez, antitest-antigén komplex, kicsapás, csapadék kimosása és az antigén disszociációja az immunkomplexből.

Protokoll a FLAG fúziós fehérjék immunprecipitációjához (IP) olyan M2 affinitási gélekkel, amelyek keresztkötésű 4%-os agarózgyöngyökhöz kovalensen kötött M2 monoklonális antitestet tartalmaznak<

EZ view red anti-FLAG M2 affinitás gél F2426, vagy Anti-FLAG M2 affinitás gél A2220 használata.

Kis mennyiségű FLAG fúziós fehérje tisztítása

Megjegyzés: Az immunprecipitációs eljáráshoz két kontrollreakciót ajánlunk

• Pozitív kontroll (FLAG-BAP fúziós fehérje, mint az Amino-terminális&.nbsp;P7582, karboxi-terminális P7457 vagy Met-FLAG-BAP fúziós fehérje P5975)
P5975)
• Negatív kontroll (reagens vak, NEM fehérjével)

a) Óvatosan keverjük össze az affinitás gélgyöngyöket, amíg teljesen fel nem szuszpendálódnak. Azonnal aliquotáljon 40 µL-t az 50%-os szuszpenzióból (20 µL csomagolt gél térfogat) egy 1,5 ml-es mikrocentrifugacsőbe egy széles nyílású pipettahegy segítségével, vagy vágjon le 1 mm-t egy normál pipettahegy végéből.

b) Mossa/egyenlítse ki a gyöngyöket: Adjunk hozzá 500 µl TBS-t (50 mM Tris HCL, 150 mM NaCl, pH 7,4), keverjük össze, és centrifugáljuk 30-60 másodpercig 5000-8200 x g-n. Távolítsuk el a felülúszót, ügyelve arra, hogy ne zavarjuk meg a gyöngyöket.

c) Mossuk ismét a fentiek szerint, és tegyük a csövet jégre, amíg a minta hozzáadására készen áll.  Megjegyzés: Ha egyszerre több immunprecipitációs mintát dolgozunk fel, a összevont szükséges gyantamennyiséget együtt lehet mosni. Minden egyes mosást TBS-sel kell elvégezni, legalább a teljes csomagolt géltérfogat 20-szorosának megfelelő térfogatban. A mosás után a gyanta aliquotálható a kívánt számú mintához.

d) Mintaelőkészítés:

• Centrifugálással (14 000 x g 10-15 percig 2-4°C-on)
• Kalkulálja ki a szükséges lizátum mennyiségét. A mennyiség a FLAG fúziós fehérje expressziós szintjétől függ a transzfektált sejtekben.

e) Bind: Adjunk hozzá 200-1000 µl sejtlizátumot (ha szükséges, a végső térfogatot lízispuffer hozzáadásával [50 mM Tris HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100] 1 mL-re növeljük). Megjegyzés: a lizátum térfogata a transzfektált sejtekben lévő FLAG fúziós fehérje expressziós szintjétől függ. A pozitív kontrollhoz adjunk hozzá 1 ml TBS-t és 4 µl 50 ng/µl FLAG-BAP fúziós fehérjét (kb. 200 ng). A negatív kontrollhoz csak 1 mL lízispuffert adjunk hozzá. Inkubáljuk az összes mintát és kontrollt rázással, görgős rázógép vagy vég-felül-rázógép segítségével kb. 1-2 órán át 2-8°C-on (a kötési lépés a maximális kötés biztosítása érdekében egy éjszakára is meghosszabbítható).

f) Centrifugáljuk a csövet 30 mp-1 percig 5000-8200 x g-nél, és szívjuk le a felülúszót (átfolyó folyadékot). Az átfolyást kívánság szerint meg lehet tartani.

g) Mossuk le a gyöngyöket: Adjunk hozzá 500 µl TBS-t, vortexeljük és centrifugáljuk 30 mp-1 percig 5000- 8 200 x g-n. Távolítsuk el a felülúszót

h) Ismételjük meg a mosást még kétszer.

i) A minta kioldása: Három elúciós módszer végezhető, a választás a jelölt fehérje jellemzőitől, valamint a downstream alkalmazástól függ."

1. A FLAG fúziós fehérje elúciója natív körülmények között 3X FLAG peptiddel (F4799) történő versengéssel érhető el. Ez az elúció a leghatékonyabb módszer.
2. Az elúció savas körülmények között is elvégezhető 0,1 M glicin HCl, pH 3,5 használatával. Ez az elúciós módszer gyors és hatékony, de megköveteli a minta azonnali semlegesítését.
3. Az elúció elektroforézissel is elvégezhető SDS-PAGE mintapuffer használatával. Ha ezt a módszert alkalmazzuk, a gyöngyök nem használhatók fel újra, mivel az SDS denaturálja az M2 antitestet.

Elúció 3X FLAG peptiddel (F4799)

i. A 3X FLAG peptid elkészítése:

• Oldjuk fel a 3X FLAG peptidet 0,5 M Tris HCL-ben, pH 7.5 1 M NaCl-ban 25 µg/µL végkoncentrációban
• A törzsoldatot 5-szörösére hígítjuk diH₂0-val 5 µg/µL végkoncentrációra.g/µL
• Készítsük el az Elúciós munkaoldatot 150 ng/µL koncentrációban úgy, hogy 3 µL 5 µg/µL törzsoldatot adunk 100 µL TBS-hez.

ii. Adjunk 100 μL 3X FLAG elúciós munkaoldatot minden egyes mintához, és inkubáljuk 30 percig 2-8 °C-on, enyhe rázogatás mellett.

iii. Centrifugáljon 30 másodperc-1 percig 5000-8200 x g-n. A felülúszót vigye át egy új csőbe. Vigyázzunk, hogy ne kerüljön át gyanta.

1. Elválasztás savas körülmények között (0,1 M glicin HCl pH -3,5) Az eljárást szobahőmérsékleten végezzük.

i. Adjunk 100 µl 0,1 M glicin HCl-t, pH 3,5, minden egyes mintához
ii. Inkubáljuk 5-10 percig enyhe rázogatás mellett
iii. Centrifugáljuk a gyantát 30 mp-1 percig 5000-8200 x g-n
iv. Semlegesítsük a mintát a felülúszó 10 µl 0,5 M Tris HCl, pH 7,4, 1,5 M NaCl-t tartalmazó friss csövekbe történő átöntésével
v. Használjuk fel azonnal, vagy tároljuk -20°C-on hosszú távon.

2. Elválasztás SDS-PAGE mintapufferrel (62,5 mM Tris HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% (v/v) glicerin és 0.002% brómfenol-kék. Az eljárást szobahőmérsékleten végezzük.

Megjegyzés: Az antitest denaturálódásának minimalizálása érdekében nem szabad redukálószert (DTT vagy 2-merkaptoetanol) használni. A redukálószerek hozzáadása disszociálja az immobilizált M2 antitest nehéz és könnyű láncait (25-50kDa sávok)

i. Adjunk minden egyes mintához 20 µl 2X mintapuffert
ii. Forraljuk a mintákat 3 percig
iii. Centrifugáljuk 30 mp - 1 percig 5000-8200 x g-n
iv. A felülúszót tegyük át friss csőbe. A minták készen állnak az SDS-PAGE-ra történő betöltésre.

 

1. ábra. Összefoglaló az alacsony fehérjetartalmú fehérjék tételes immunprecipitációjához használt lehetőségekről