A DNS-kötő fehérjék tisztítása vagy eltávolítása

Heparin Sepharose, Heparin Sepharose 6 Fast Flow, Capto Heparin

A DNS-kötő fehérjék a fehérjék rendkívül változatos osztályát alkotják, amelyeknek egyetlen közös jellemzőjük van, a DNS-hez való kötődés képessége. Funkcionálisan a csoport a DNS replikációjáért és orientációjáért felelős csoportra osztható, mint például a hisztonok, nukleoszómák és replikázok, valamint az átírásban részt vevőkre, mint például az RNS/DNS-polimerázok, transzkripciós aktivátorok és represszorok és restrikciós enzimek. A specifikusabb tisztítást lehetővé tévő, jelölt fehérjékként is előállíthatók, de a DNS-hez való kötődésük lehetővé teszi a csoport-specifikus tisztítást is, ha ligandumként heparint használnak. A heparin egy magas szufonáltságú glikozaminoglikán, amely a biomolekulák igen széles skáláját képes megkötni, többek között:

• DNS-kötő fehérjéket, például iniciációs faktorokat, elongációs faktorokat, restrikciós endonukleázokat, DNS-ligázokat, DNS- és RNS-polimerázokat.
• Serin proteáz inhibitorok, mint például antitrombin III, proteáz nexinek.
• Enzimek, mint például hízósejt proteázok, lipoprotein lipáz, koagulációs enzimek, szuperoxid diszmutáz.
• Növekedési faktorok, mint például fibroblast növekedési faktor, Schwann-sejt növekedési faktor, endotélsejt növekedési faktor.
• Extracelluláris mátrix fehérjék, mint például fibronektin, vitronektin, laminin, tromboszpondin, kollagének.
• Hormonreceptorok, mint például az ösztrogén- és androgénreceptorok.
• Lipoproteinek.

A heparin szerkezetét a 3.10. ábra mutatja. A heparinnak kétféle kölcsönhatási módja van a fehérjékkel, és mindkét esetben a kölcsönhatás gyengülhet az ionerősség növelésével.

1. A DNS-kötő fehérjékkel való kölcsönhatásában a heparin a nukleinsav polianionos szerkezetét utánozza.
2. A véralvadási faktorokkal, például az antitrombin III-mal való kölcsönhatásában a heparin affinity ligandként viselkedik.

3.10. ábra. Egy heparin poliszacharid szerkezete, amely váltakozó hexuronsav (A) és D-glükózamin maradékokból (B) áll. A hexuronsav lehet D-glükuronsav (fent) vagy annak C-5 epimerje, az L-iduronsav (lent). R1 = -H vagy -SO3-, R2 = -SO3- vagy -COCH3.

Kromatográfiás közegek jellemzői

A DNS-kötő fehérjék tisztítására vagy eltávolítására szolgáló kromatográfiás közegek jellemzőit a 3.11. táblázat tartalmazza.

3.11. táblázat A heparin szefaróz és a Capto heparin kromatográfiás közegek jellemzői

	Ligandsűrűség (mg/ml)		Összetétel	pH-stabilitás1	Átlagos részecskeméret (µm)
Heparin Sepharose High Performance	10		A heparin reduktív aminálással kapcsolódik a Sepharose High Performance-hoz, hogy lúgos körülmények között is stabil kötődést biztosítson.	Rövid távú: 5-től 10-ig Hosszú távú: 5-től 10-ig	34
Heparin Sepharose 6 Fast Flow		5.0		A heparin reduktív aminálással kapcsolódik a Sepharose 6 Fast Flow-hoz, hogy lúgos körülmények között is stabil kötődést biztosítson.	Rövid távú: 4-13 Hosszú távú: 4-12	90
Capto Heparin	1.8	Capto-hoz kapcsolt heparin	Rövid távú: 4-13 Hosszú távú: 4-12	90

¹ A rövid távú a regenerálási, helyben történő tisztítási és fertőtlenítési eljárások pH-intervallumára utal. A hosszú távú arra a pH-intervallumra utal, amely mellett a közeg hosszú időn keresztül stabil, anélkül, hogy a későbbi kromatográfiás teljesítményére káros hatással lenne.

Purifikációs lehetőségek

A Heparin Sepharose 6 Fast Flow kromatográfiás közeg és előrecsomagolt oszlopok, valamint a Capto Heparin számára a 3.12. táblázatban találhatóak a purifikációs lehetőségek.

A 3.12. táblázatban látható.

3.12. táblázat A DNS-kötő fehérjék tisztítási lehetőségei

	Megkötési kapacitás		Maximális üzemi flow	Kommentárok1
HiTrap® Heparin HP, 1 ml		Szarvasmarha antitrombin III, 3 mg/oszlop	4 ml/perc	Előkészített 1 ml-es oszlop
HiTrap® Heparin HP, 5 mL
Szarvasmarha antitrombin III, 15 mg/oszlop		20 mL/min		Előrecsomagolt 5 ml-es oszlop
HiPrep Heparin FF 16/10	Szarvasmarha antitrombin III, 40 mg/oszlop		10 mL/min	Előkészített 20 ml-es oszlop.
Heparin Sepharose 6 Fast Flow		Szarvasmarha antitrombin III, 2 mg/ml közegben	400 cm/h1		Az oszlopcsomagolásra kész szuszpenzióként szállítjuk.
Capto heparin		Antitrombin III, 1.4 mg/ml közegben	700 cm/h2		Az oszlopcsomagolásra kész szuszpenzióban szállítjuk

¹ Lásd 4. függelék az flow-sebesség (cm/h) átváltásához térfogati flow-sebességre (ml/min). A maximális üzemi flow-t 10 cm-es ágymagasságú és 5 cm-es i.d.-vel rendelkező tömött oszlopban végzett mérésből számították ki.

² 1 m átmérőjű oszlop, 20 cm ágymagasság.

Purifikációs példák

A 3.11-3.13. ábrák példákat mutatnak a különböző DNS-kötő fehérjék purifikációjához használt körülményekre.

3.11. ábra. A rekombináns HIV-reverz transzkriptáz részleges tisztítása Hi Trap Heparin HP-n

3.12. ábra. A rekombináns DNS-kötő Oct-1 fehérje részleges tisztítása (Dr. Gunnar Westin, University Hospital, Uppsala, Svédország) HiTrap® Heparin HP, 5 mL használatával.

3.13. ábra. scCro8 tisztítás HiPrep Heparin FF 16/10-en.

Az elválasztás végrehajtása

Heparin Sepharose 6 Fast Flow, Heparin Sepharose High Performance

Megkötő puffer:		20 mM Tris-HCl, pH 8,0 vagy 10 mM nátrium-foszfát, pH 7.0
Elúciós puffer:	20 mM Tris-HCl, 1-2 M NaCl, pH 8,0 vagy 10 mM nátrium-foszfát, 1-2 M NaCl, pH 7,0

1. Egyensúlyozza az oszlopot 10 CV kötőpufferrel.
2. Alkalmazza a mintát.
3. Mossa le 5-10 CV kötőpufferrel vagy addig, amíg az eluensben nem jelenik meg anyag (az A280 nm-en történő UV-abszorpcióval ellenőrizve).
4. Elúciózza 5-10 CV elúciós pufferrel, folyamatos vagy lépcsőzetes gradiens alkalmazásával 0%-tól 100%-os elúciós pufferig.

Módosítsa a heparin szelektivitását a pufferek pH-jának vagy ionerősségének megváltoztatásával. Elutáljon NaCl, KCl vagy (NH4)2SO4 folyamatos vagy lépcsős gradiens alkalmazásával 2 M-ig.

Ha alvadási faktorok tisztítására vagy eltávolítására használjuk:

Mivel a heparin affinity ligandként hat az alvadási faktorok számára, célszerű legalább 150 mM NaCl koncentrációt bevinni a kötőpufferbe.

Ha a növekvő sógradiens nem ad kielégítő eredményt, használjon heparint (1-5 mg/ml), mint konkurens anyagot az elúciós pufferben.

Tisztítás

Az ionikusan kötött fehérjéket mosással távolítsa el 0.5 CV 2 M NaCl 10-15 percig tartó mosásával.

A kicsapódott vagy denaturált fehérjéket 4 CV 100 mM NaOH-val 1-2 órán keresztül; vagy 2 CV 6 M guanidin-hidrokloriddal 30-60 percig; vagy 2 CV 8 M karbamiddal 30-60 percig történő mosással távolítsuk el. A hidrofób kötésű fehérjéket 4 CV 0,1-0,5%-os Tween 20-mal történő 1-2 órás mosással távolítsuk el.

Kémiai stabilitás

100 mM NaOH (1 w 20 °C-on), 50 mM nátrium-acetát, pH 4,0, 4 M NaCl, 8 M karbamid, 6 M guanidin-hidroklorid.

Tárolás

Mossuk a kromatográfiás közegeket és oszlopokat 50 mM nátrium-acetáttal, amely 20% etanolt tartalmaz (kb. 5 CV-t használjunk a csomagolt közegekhez), és tároljuk 4 °C és 8 °C között.

Capto Heparin

Megkötő puffer:		100 mM Tris-HCl, 10 mM trinátrium-citrát, 225 mM NaCl, pH 7.4
Mosópuffer:	100 mM Tris-HCl, 10 mM trinátrium-citrát, 330 mM NaCl, pH 7.4
Elúciós puffer:	100 mM Tris-HCl, 10 mM trinátrium-citrát, 2 M NaCl, pH 7,4

1. Ekvibráljon 5 CV kötőpufferrel.
2. Alkalmazza a mintát.
3. Mosási lépés 1: mossa 40 CV kötőpufferrel.
4. Mosási lépés 2: mossa 15 CV mosópufferrel.
5. Elúció 9,5 CV elúciós pufferrel.

Egy 1 ml-es oszlophoz 0,5 ml/perc flúziós sebesség ajánlott.

Tisztítás

A regenerálás során nem eluálódó anyagok, például denaturált fehérjék, a helyben történő tisztítással (CIP) eltávolíthatók. A Capto Heparinhoz ajánlott CIP eljárás 4 CV 100 mM NaOH, 1-2 óra kontaktidővel.

Tárolás

A fel nem használt kromatográfiás közegeket 4 ºC és 30 ºC között tároljuk 20%-os etanolban és 50 mM nátrium-acetátban.