A natív komplexek izolálásának elvégzése

A természetes multifehérje-komplexek (nem rekombináns, affinity tagek nélkül) tisztíthatók strukturális és funkcionális vizsgálatokhoz klasszikus biokémiai módszerekkel. A célkomplex természetes forrását használják kiindulási anyagként a purifikációhoz, és kromatográfiás és egyéb technikák kombinációját alkalmazzák a komplex izolálásához. Ez a megközelítés elvileg megegyezik azzal, amelyet az 1960-as évek óta sikeresen alkalmaznak az egyes fehérjék izolálására.

Ezzel a megközelítéssel kapcsolatban néhány megfontolandó szempontot az 1. táblázat sorol fel.

1. táblázat. A natív komplexek klasszikus biokémiai megközelítéssel történő izolálásánál figyelembe veendő szempontok.

Pros	Cons
A megfelelő biológiai forrás használata korlátozza a műtárgyak kockázatát	Nagy mennyiségű kiindulási anyag szükséges a természetesen alacsony abundanciájú komplexek izolálásához
Nincs manipuláció (pl.g., affinity tagging) az alegységek manipulálása korlátozza a leletképződés kockázatát		Minden komplexhez új tisztítási eljárást kell empirikusan kidolgozni. A tisztítási sémák általában több kromatográfiás lépést tartalmaznak és fáradságosabbak, mint a jelölt fehérjék esetében
Nincs szükség a komplex újbóli összerakására - korlátozza az artefaktumok kockázatát

A tisztítási sémát úgy lehet a legjobban megtervezni, ha az ortogonális technikákat egymás után kombináljuk, például az affinity kromatográfiát (elválasztás a bioszpecifizitás szerint), az ioncserét (elválasztás a töltési tulajdonságok szerint) és a gél filtrációt (elválasztás a méret szerint). A különböző technikákat úgy kell kombinálni, hogy a tisztítási lépések között a lehető legkisebb legyen a mintakezelésre vonatkozó követelmény (lásd A különböző tisztítási technikák alapelvei és standard feltételei). A hasznos kromatográfiás technikákat a 2. táblázat mutatja be.

2. táblázat. Kromatográfiás technikák és megfontolások a multiprotein komplexek tisztításához.

Technika	A szétválasztás elve	A többprotein komplexek tisztításának előnyei (+) és hátrányai (-)
Gél filtráció	Méret és alak	Méret és alak	.+ Enyhe elválasztási feltételek; az elválasztás széles pH- és ionerősség-tartományban érhető el + Adalékanyagok használhatók
Affinity kromatográfia	Biospecific affinity	+ Kiváló specificity - Affinity.nitású ligandumok (a kromatográfiás gyöngyökhöz) nem minden fehérjéhez találhatók - Az eluáláshoz olyan körülményekre (pH, ionerősség) lehet szükség, amelyek megzavarhatják a komplexen belüli kölcsönhatásokat
	Ioncserélő kromatográfia	Töltés	+ Gyakran nagy felbontás érhető el
Hidrofób kölcsönhatás kromatográfia
Hidrofób kölcsönhatás kromatográfia	Hidrofóbitás	+ Hasznos kiegészítője a többi technikának - Nagy sókoncentrációk (pl.g., 1-2 M ammónium-szulfát) gyakran alkalmaznak a minta felvitele során. Ez megzavarhatja a komplexen belüli kölcsönhatásokat

A tisztítási hozam maximalizálása érdekében fontos, hogy a lépések számát a lehető legkisebbre csökkentsük. A kihívást jelentő tisztításoknál azonban, mint például a több fehérje komplexek esetében, nagyobb számú tisztítási lépést kell alkalmazni a kívánt tisztaság eléréséhez. Például a humán (20S) proteaszómát (amely 14 alegységet tartalmaz, Mr ~700 000) és prekurzor komplexeket egy humán sejtvonalból anioncserélő kromatográfia, szacharóz gradiens centrifugálás, affinitás kromatográfia, hidrofób kölcsönhatás kromatográfia és gél filtráció kombinációjával izolálták.

A komplex purifikáció során kerülni kell a szélsőséges pH-értékkel vagy ionerősséggel járó kemény elválasztási körülményeket, hogy minimalizáljuk az alegységek disszociációjának kockázatát a purifikációs folyamat során.

A gél filtráció méret szerint választ el, és ideális technika a multifehérje-komplexek izolálására, mivel kíméletes, és azért is, mert sok komplex sokkal nagyobb, mint a fő szennyezőanyagok. A fehérjekomplexek és nagy molekulák számára hasznos gél filtrációs közegeket a 3. táblázat sorolja fel.

3. táblázat. Nagy porozitású gél filtrációs közeg, amely így különösen alkalmas több fehérje komplex tisztítására.

Termék	Hasznos elválasztási tartomány*	Kommentár
Superdex 200	10 000 - 600 000	Elérhető előrecsomagolt oszlopként
Superose™ 6	5 000-5 000 000	Előrecsomagolt oszlopként kapható
Sephacryl™ S-300 HR	10 000 - 1 500 000	Elkész csomagolt oszlopként kapható
Sephacryl S-400 HR	20 000 - 8 000 000
Sephacryl S-500 HR	Nincs adat (nagyobb porozitás, mint a Sephacryl S-400 HR)	Kizárási határ ~200 nm
Sephacryl S-1000 SF	Nincs adat (nagyobb porozitás, mint a Sephacryl S-500 HR)	Kizárási határ ~400 nm

*Mr a globuláris fehérjék esetében