Puffercsere és sótalanítás affinitáskromatográfiához

A szakirodalomban gyakran említik a dialízist mint a só vagy más kismolekulák eltávolítására és a minta pufferösszetételének cseréjére szolgáló technikát. A dialízis azonban általában nagyon lassú technika, és nagy mennyiségű puffert igényel. A kezelés során, illetve a proteolitikus lebontás vagy a dialízismembránokhoz való nem specifikus kötődés következtében fennáll az anyagvesztés veszélye. Egyszerűbb és sokkal gyorsabb technika a Sephadex G-25-össel töltött sótalanító oszlop használata a nagy és kis molekulatömegű anyagok csoportos elválasztására. A fehérjéket elválasztjuk a sóktól és más kis molekuláktól.

Egy gyors, egyetlen lépésben a mintát sótalanítjuk, új pufferbe helyezzük át, és eltávolítjuk az alacsony molekulatömegű anyagokat.

A sótalanító oszlopok nemcsak az alacsony molekulatömegű szennyező anyagok, például a só eltávolítására szolgálnak, hanem a különböző kromatográfiás lépések előtt vagy után puffercserére, valamint a reagensek gyors eltávolítására a reakció befejezéséhez is.

A sótalanító oszlop teljes térfogatának akár 30%-át kitevő mintamennyiségek is feldolgozhatók. A mintakoncentráció nem befolyásolja az elválasztást, amennyiben a fehérjék koncentrációja nem haladja meg a 70 mg/ml-t normál vizes pufferek használata esetén. A mintának teljesen fel kell oldódnia. Centrifugálással vagy flterrel távolítsa el a részecskés anyagokat.

Kis mintamennyiségek esetén lehetséges a minta hígítása a kromatográfiás tisztításhoz használandó pufferrel, de a sejttörmeléket és a részecskéket továbbra is el kell távolítani.

Az esetleges ionos kölcsönhatások megelőzése érdekében a sótalanítás során és a végső mintapufferben alacsony sókoncentráció (25 mM NaCl) alkalmazása ajánlott.

Az illékony pufferek, például 100 mM ammónium-acetát vagy 100 mM ammónium-hidrogén-karbonát használható, ha a NaCl jelenlétét el kell kerülni.

A 76. ábra egy tipikus puffercsere és sótalanítás elválasztását mutatja. A folyamat az UV-abszorpció és a vezetőképesség változásainak követésével nyomon követhető.

76. ábra. Egérplazma (10 ml) puffercseréje HiPrep™ 26/10 sótalanítással.

Laboratóriumi méretű műveletekhez a 16. táblázat az előrecsomagolt, használatra kész sótalanító és puffercserélő oszlopok kiválasztási útmutatóját mutatja be.

16. táblázat Kiválasztási útmutató a sótalanításhoz és a puffercseréhez.

Oszlop	Mintamennyiség	Mintamennyiség	Minta elúciós térfogata
MicroSpin G-25	0.1-0,15 ml	0,1-0.15 ml
PD-10 (gravitációs oszlop)	1,5-2.5 ml	2,5-3.5 ml
HiTrap® Sótalanítás 5 mL	0.25-1,5 mL	1.0-2,0 ml
HiPrep™ 26/10 sótalanítás	2.5-15 ml	7,5-20 ml

Nagyobb mintamennyiségek sótalanításához:

• Sorosan csatlakoztasson akár 5 HiTrap^® 5 ml-es sótalanító oszlopot a mintatérfogat kapacitásának növeléséhez, pl. 2 oszlop: 3 ml mintatérfogat, 5 oszlop: 7 ml mintatérfogat.5 mL.
• Sorozatban akár 4 HiPrep^™ 26/10 sótalanító oszlopot is csatlakoztathat a mintatérfogat-kapacitás növeléséhez, pl. 2 oszlop: 30 mL mintatérfogat, 4 oszlop: 60 mL mintatérfogat. Még 4 oszlop sorozatban történő alkalmazásával is 20-30 perc alatt feldolgozható a minta, szobahőmérsékleten, vizes pufferben.

Az utasításokat minden oszlophoz mellékeljük. A sótalanítás és a puffercsere kevesebb mint 5 percet vesz igénybe mintánként, a legtöbb fehérje esetében 95%-nál nagyobb visszanyerés mellett.

1. alternatíva: Kézi sótalanítás a HiTrap^® sótalanítóval 5 ml sótalanítás fecskendővel

1. Töltse meg a fecskendőt pufferrel. Távolítsa el a dugót. Annak érdekében, hogy elkerülje a levegő bejutását az oszlopba, csatlakoztassa az oszlopot "cseppenként" a fecskendőhöz (a mellékelt adapteren keresztül).
2. Vegye ki a lecsavarható véget.
3. Mossa az oszlopot 25 ml pufferrel 5 ml/perc sebességgel, hogy teljesen eltávolítsa a 20%-os etanolt (tárolási pufferként mellékelve). Ha levegő rekedt az oszlopban, mosson gáztalanított pufferrel, amíg a levegő el nem tűnik. A minta felvitele során véletlenül az oszlopra került légbuborékok nem befolyásolják az elválasztást.
4. A mintát 2-5 ml-es fecskendővel, 1-10 ml/perc közötti flúvási sebességgel vigye fel. Dobja el az oszlopból eluált folyadékot.
5. Ha a minta térfogata kevesebb, mint 1,5 mL, váltson pufferre, és folytassa az injektálást, amíg összesen 1,5 mL nem eluálódik. Dobja el az eluált folyadékot.
6. Elutálja a fehérjét a 16. táblázatból kiválasztott megfelelő térfogattal.

A sótalanított fehérjét a megadott térfogatban gyűjtse össze.

Megjegyzés: 5 ml/perc körülbelül 120 csepp/percnek felel meg, ha egy HiTrap^® 5 ml-es oszlopot használ. Egy egyszerű perisztaltikus pumpa is használható a minta és a pufferek adagolásához.

A maximális ajánlott mintatérfogat 1,5 ml. Az oszlopra felvitt mintamennyiség csökkentésének hatásairól lásd a 17. táblázatot.

17. táblázat Ajánlott minta- és elúciós térfogatok fecskendő vagy Multipipette™ használatával.

Mintatöltet mL	Adjunk hozzá puffert mL	Elhígítás és gyűjtés mL	Kihozatal %	Maradék só %		Hígítási tényező
0.25	1.25	1.0	> 95	0.0	4.0
0.50	1.0	1.5	> 95	< 0.1	3.0
1.00	0.5	2.0	> 95	< 0.2	2.0
1.50	0	2.0	> 95	< 0.2	1.3

A minta és a pufferek felvitelére egy egyszerű perisztaltikus szivattyú is használható.
Alternatíva 2: Egyszerű sótalanítás az ÄKTAprime plus-szal

Az ÄKTAprime plus előre programozott sablonokat tartalmaz az egyes HiTrap^® 5 ml-es sótalanító és HiPrep^™ 26/10-es sótalanító oszlopokhoz.

Puffer előkészítése

Készítsen elő legalább 500 ml-t a szükséges pufferből.

1. Az oszlop csatlakoztatásához és a rendszer pufferrel való feltöltéséhez kövesse az ÄKTAprime plus segédkártyán található utasításokat.
2. Válassza ki az Alkalmazás sablonját.
3. Indítsa el a módszert.
4. Adja meg a minta mennyiségét, és nyomja meg az OK gombot.

A 77. ábra egy tipikus, az ÄKTAprime plus segítségével kapott eredményt mutat. Az UV (fehérje) és a vezetőképesség (só) nyomok lehetővé teszik a sótalanított frakciók összevonását.

77. ábra. (His)6 fúziós fehérje sótalanítása ÄKTAprime plusszal.