Immunoprecipitációs készlet (Protein G) Protokoll és hibaelhárítás

 

IMMUNOPRECIPITÁCIÓ IMMOBILIZÁLT PROTEIN G-vel

Az immunprecipitációt a fehérjék komplex keverékében lévő célantigének elemzésére használják. Az érdeklődésre számot tartó fehérje egy lépésben koncentrálható és tisztítható analitikai léptékben egy specifikus antitest segítségével. Gyakran az immunprecipitált fehérjék funkcionálisan aktívak, és tovább elemezhetőek enzimatikus aktivitás, kölcsönhatások, módosulások és szerkezet szempontjából.

A készlet (termékszám: 11719386001) tartalmazza a fehérjék sejtlíziséhez, szolubilizálásához, stabilizálásához és immunopurifikálásához szükséges összes reagenseket.

Cellulízis és mintaelőkészítés

1. A sejteket/szövetet legalább kétszer mossa át jéghideg PBS-szel, hogy eltávolítsa a tenyésztőközegben maradt szérumfehérjéket. Egy immunprecipitációs reakcióhoz 1-3 ml mintatérfogat ajánlott. Mikrocentrifuga használatával 1 ml térfogat az optimális.

• Az adherens sejteket a monolayerhez PBS hozzáadásával és a felülúszó eltávolításával kell mosni. Adjunk +2 és +8 °C-ra lehűtött lízispuffert a hűtött, mosott sejtmonolayerekhez, hogy 10⁶ -10⁷ sejt/mL koncentrációt érjünk el. A sejteket egy megfelelő eszközzel kaparja a tál egyik oldalára.
• A szuszpenzióban lévő sejteket centrifugálással és a pellet újraszuszpendálásával PBS-szel kell mosni. Az utolsó mosás után távolítsa el a felülúszót. A sejtpelletet +2-8 °C-ra lehűtött lízispufferben reszuszpendálja 10⁶ -10⁷ sejt/ml koncentráció eléréséig, és vigye át egy megfelelő homogenizáló eszközbe.
• A szilárd szövetet PBS hozzáadásával és a felülúszó eltávolításával kell mosni. Adjon a mintához lízispuffert, hogy 5-20 mg szövet/mL koncentrációt érjen el.

2. Vigye át a mintát egy jégen előhűtött Dounce homogenizátorba vagy bármely más típusú mikro-homogenizátorba. Vegye figyelembe, hogy a homogenizálási eljárás kritikus lehet a célantigén funkcionális integritása szempontjából. Egy B típusú pestis segítségével ismételt ütésekkel (kb. 10) homogenizáljon.

3. A homogenizált szuszpenziót 12 000 × g, 10 perc, +2 és +8 °C között, asztali mikrofúgában centrifugálja a törmelék eltávolítása érdekében. Alternatív megoldásként a nagy sebességű felülúszó előállításához centrifugáljuk 100 000 × g-nél, 45 percig, +2 és +8 °C között.

4. Válasszuk le a felülúszót, és töltsük át egy mikrofúziós csőbe (optimális térfogat 1 ml).

Ertisztítás Protein G agarózzal

Az irreleváns sejtfehérjék Protein G agarózhoz való nem specifikus adszorpciója által okozott háttér csökkentése érdekében ajánlott egy előtisztítási lépés.

5. Adjon 50 μL homogén Protein G agaróz szuszpenziót (25 μL ágytérfogat) 1-3 ml mintához, és inkubálja +2 és +8 °C közötti hőmérsékleten legalább 3 órán át vagy egy éjszakán át hintáztatva.

6. Pelletáljuk a gyöngyöket gravitációs szedimentációval vagy mikrofúgában 20 másodpercig 12 000 × g-nél végzett centrifugálással. A felülúszókat vigye át friss csövekbe.

A célfehérje immunprecipitációja

7. Adjon hozzá megfelelő mennyiségű specifikus ellenanyagot, és óvatosan ringassa +2 és +8 °C között egy órán keresztül.

8. Adjunk a keverékhez 50 μL homogén Protein G agaróz szuszpenziót, és inkubáljuk +2 és +8 °C között legalább három órán át vagy egy éjszakán át hintáztatva.

9. Gyűjtsük össze a komplexeket gravitációs szedimentációval vagy mikrofúgában 20 másodpercig 12 000 × g-nél végzett centrifugálással.

10. Óvatosan távolítsuk el a felülúszót, adjunk hozzá 1 ml 1-es mosópuffert, szuszpendáljuk újra a gyöngyöket, és inkubáljuk +2 és +8 °C között 20 percig ringató platformon.

11. Ismételjük meg a 9. és 10. lépést.

12. Gyűjtsük össze a komplexeket a 9. lépésben leírtak szerint, távolítsuk el a felülúszót, szuszpendáljuk újra a pelletet 1 ml 2. mosópufferben, inkubáljuk +2 és +8 °C között 20 percig ringató platformon, pelletáljuk újra a gyöngyöket és távolítsuk el a felülúszót.

13. Ismételje meg a 12. lépést.

14. Adjunk 1 ml 3. mosópuffert a pellethez, szuszpendáljuk újra, inkubáljuk +2 és +8 °C között 20 percig ringató platformon, pelletáljuk újra a gyöngyöket és távolítsuk el a felülúszót.

15. Távolítsa el az utolsó mosás utolsó nyomait az agaróz pelletről és a mikrofúziós cső faláról és fedeléről.

Gélelektroforézis

Az immunprecipitált fehérjéket bármilyen egy- vagy kétdimenziós elektroforézis rendszerrel elválaszthatók, amely elegendő fehérjefelbontást biztosít. Az SDS-poliakrilamid gélelektroforézis vagy a kétdimenziós elektroforézis részletes protokollját lásd valamelyik szabványos tankönyvben vagy az elektroforézis berendezés gyártóinak kézikönyveiben.

1. Adjunk 25-75 μL géltöltő puffert az immunprecipitátumhoz.
2. Denaturáljuk a fehérjéket 3 percig +100 °C-ra történő melegítéssel. Távolítsa el a Protein G agarózt 12 000 × g-nél 20 másodpercig tartó, +15 és +25 °C közötti hőmérsékleten végzett centrifugálással mikrofúgában. A felülúszót vigye át egy friss csőbe.
3. Egy aliquotot elemezzen SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel.

Western Blotting

Az elektroforézis után a gélt nitrocellulóz vagy PVDF membránra blottolja a standard Western blot protokoll segítségével. A membrán sérülésének vagy szennyeződésének elkerülése érdekében a kezelés során mindig viseljen kesztyűt.

1. A hidrofób membránokat, mint például a PVDF, néhány másodpercig metanollal kell nedvesíteni, majd legalább 5 percig transzferpufferrel áztatni. A nitrocellulózt rövid ideig vízben, majd legalább 5 percig transzferpufferben kell áztatni.
2. A transzfer előtt a gélt 5-10 percig alaposan egyensúlyba kell hozni a transzferpufferben.
3. A blot a standard protokollok szerint.
4. A blot szükség esetén több hónapig szárazon, hűtőszekrényben tárolható, de az immundetektálás megkezdése előtt újra kell nedvesíteni. A PVDF-membránokat metanolban vagy 5%-os Tween 20 (v/v) oldatban kell újra nedvesíteni.

Hibaelhárítás

Nincs jel

Mintakészítés immunprecipitáció

• Az antigén lebomlásának kockázatának csökkentése érdekében a minta előkészítése során további specifikus proteáz inhibitorokat tartalmazzon.
• Növelje az elsődleges antitest koncentrációját 5 μg/ml-ig.
• Az alacsony affinitású antitestek esetében használjon alacsonyabb szigorral rendelkező mosópuffereket (pl., 150 mM NaCl, detergens nélkül)
• Ellenőrizze az elsődleges ellenanyag affinitását a Protein G agarózhoz. Ha az elsődleges antitest affinitása alacsonynak bizonyul, váltson megfelelő mátrixra.

Detektálás

• Ellenőrizze, hogy a fehérje megfelelően került-e át a membránra a blottolás során.

Ellenőrizze, hogy a fehérje megfelelően került-e át a membránra.>Ha a transzfer nem volt hatékony, különösen a nagy molekulatömegű fehérjék esetében, változtasson a transzfer körülményein (hosszabbítsa meg a transzferidőt, növelje az áramot vagy váltson alternatív transzferpufferre.

Nagy molekulatömegű sávok hiányoznak-->növelje a blottolási időt vagy változtassa meg a transzferpuffert.

Ellenőrizze a másodlagos antitest konjugátum enzimaktivitását. Pöttyözze az enzim-konjugátum különböző hígításait blotting membránra és detektálja közvetlenül. Ha nem jelenik meg jel, használjon friss enzim-konjugátumot, és tesztelje ugyanígy. Ha még mindig nem jelenik meg jel, ellenőrizze a detektáló reagenseket.

Gyenge jelek

Mintaelőkészítés és immunprecipitáció

• Az antigén lebomlásának kockázatának csökkentése érdekében a mintaelőkészítés során további specifikus proteáz inhibitorokat tartalmazzon.
• Optimalizálja az elsődleges antitest koncentrációit.
• Hosszabbítsa meg az inkubációs időt az elsődleges antitesttel több órára +2 és +8 °C között.
• Hosszabbítsa meg az inkubációs időt a Protein G agarózzal (egy éjszakán át).
• Rövidítse meg a mosási időket. Használjon alacsonyabb szigorral rendelkező mosópuffereket (150 mM NaCl, mosószer nélkül).

Detektálás

• Növelje a gélre felvitt fehérje mennyiségét.
• Ellenőrizze a hatékony blottingot.
• Hosszabbítsa meg a detektálási időt.

Nagy háttér

Mintaelőkészítés és immunprecipitáció

Magas háttér

Minták előkészítése és immunprecipitáció

• A magas háttérrel rendelkező mintáknál több körös előabszorpcióra lehet szükség, hogy eltávolítsuk az összes, a G fehérjéhez nem specifikusan kötődő fehérjét.
• Növelje meg az ellenanyag-Protein G agaróz komplex mosási idejét az immunprecipitációt követően. Növelje a mosási feltételek szigorát.
• A bloton megjelenő háttérjelek megnövekedett szintjét a fehérjék nem specifikus csapdázása okozhatja a Protein G agaróz/antigén komplexek centrifugálása során. Ez elkerülhető a komplexek centrifugálás helyett gravitációs ülepítésével.

Detektálás

• Tiszta berendezéseket, frissen készített puffereket és új membránokat használjon.
• Hígítsa a fehérjekoncentrációt a mintában.
• Kerülje a membránok érintését. Használjon kesztyűt és tompa végű, nem fogazott hegyű csipeszt.

Nem specifikus sávok

Az immunprecipitációs lépéseket megelőzően akár háromszor is tisztítsa a mintát Protein G agarózzal, hogy eltávolítsa az összes, a protein G-hez nem specifikusan kötődő fehérjét . Ha a szérum immunglobulinok nem távolíthatók el teljesen a Protein G agaróz előtisztítás során, akkor a sejtlízist megelőzően szérummentes sejtkultúrás körülmények használata javasolt. Alternatív megoldásként a Protein G agaróz előzetesen feltölthető a kívánt mennyiségű specifikus antitesttel, a fennmaradó Protein G kötőhelyeket pedig nem specifikus kontroll antitestekkel vagy szérummal lehet blokkolni.