Tisztítás a HisTrap™ FF Crude segítségével nem klárifizált sejtlizátumból

A HisTrap™ FF crude egy használatra kész, Ni Sepharose^® 6 Fast Flow előcsomagolású oszlop a hisztidinnel jelölt rekombináns fehérjék tisztítására. Az alapos sejtbontást követően a nem klarifirozott, nyers sejtlizátum közvetlenül az oszlopra tölthető a minta centrifugálása és filtrálása nélkül.

A nem klarifirozott sejtlizátumok közvetlen betöltése csökkenti a teljes tisztítási időt, és növelheti az érzékeny célfehérjék tisztításának lehetőségét anélkül, hogy aktivitásuk elveszne.

3.14. ábra. A HisTrap™ FF nyers oszlopok lehetővé teszik a hisztidinnel jelölt fehérjék egyszerű, egylépéses tisztítását a minta előkezelése, például centrifugálás és filtrálás nélkül.

A HisTrap™ FF nyers oszlopok polipropilénből készülnek, amely biokompatibilis és nem lép kölcsönhatásba a biomolekulákkal. Az oszlopokat a bemeneten dugóval, a kimeneten pedig lecsapható véggel szállítjuk. Az oszlopok pórusos polietilén felső és alsó frittel rendelkeznek, amelyek pórusmérete optimalizált a nem klarifizált sejtlizátumok közvetlen az oszlopra történő betöltésére anélkül, hogy ellennyomási problémákat vagy a Ni Sepharose^® 6 Fast Flow gyöngyök szivárgását okoznák. Az oszlopok működtethetők fecskendővel és a mellékelt Luer-csatlakozóval, perisztaltikus szivattyúval vagy kromatográfiás rendszerrel, például ÄKTA-val. Vegye figyelembe, hogy a HisTrap™ FF nyers oszlopok nem nyithatók vagy újratölthetők.

Az 3.15. ábra a HisTrap™ FF nyers protokoll vázlatos ábráját a hagyományos IMAC-hoz képest.

3.15. ábra. A HisTrap™ FF nyers oszlopok a hagyományos IMAC-hoz képest időt takarítanak meg a hisztidinnel jelölt fehérjék tisztítása során.

Minta- és pufferelőkészítés

A minta- és pufferelőkészítés általános eljárását lásd a Purification using Ni Sepharose^® 6 Fast Flow fejezet korábbi részében.

A nem klárifizált minta közvetlen betöltése esetén kritikus fontosságú az efficiens sejtlízis elérése, hogy elkerüljük az ellennyomással kapcsolatos problémákat. A nem klarifizált lizátumot közvetlenül az előkészítés után helyezze az oszlopra.

Ha a minta túl viszkózus, hígítsa fel kötőpufferrel, hogy megakadályozza az oszlop eltömődését; növelje a lízis kezelését (szonikáció, homogenizálás); vagy adjon hozzá DNáz/RNáz-t a nukleinsavfragmentumok méretének csökkentése érdekében.

Ha a szonikázott vagy homogenizált, nem klarifizált sejtlizátumot felhasználás előtt lefagyasztjuk, a kicsapódás és az aggregáció fokozódhat. A lizátum újbóli szonikálásával ekkor megelőzhetők a megnövekedett ellennyomás-problémák az oszlopra történő betöltéskor.

Purifikáció

1. Töltse meg a szivattyúcsövet vagy fecskendőt desztillált vízzel. Távolítsa el a dugót, és csatlakoztassa az oszlopot a kromatográfiás rendszer csövéhez, fecskendőhöz (használja a mellékelt Luer-csatlakozót) vagy laboratóriumi szivattyúhoz "csepp a csepphez", hogy elkerülje a levegő bejutását a rendszerbe.
2. Vegye ki az oszlop kimeneténél lévő lecsapó véget.
3. Mossa ki az etanolt 3-5 térfogatnyi desztillált vízzel az oszlopból.
4. Kiegyenlítse az oszlopot legalább 5 térfogatnyi kötőpufferrel. Az ajánlott flow sebesség 1 ml/perc vagy 5 ml/perc az 1 ml-es, illetve az 5 ml-es oszlopokhoz.
5. A nem klárifizált lizátumot pumpával vagy fecskendővel alkalmazza. A nem klárifizett lizátum tipikus betöltési térfogata (nagymértékben függ a speciális mintától, a minta előkezelésétől és a minta betöltésekor mért hőmérséklettől):
   - HisTrap™ FF nyers 1 mL: Legfeljebb 100 ml
   - HisTrap™ FF crude 5 mL: Legfeljebb 500 mL
   
   
   Figyelembe kell venni, hogy a fehérjék kötő kapacitása is korlátozhatja a felhasználható minta mennyiségét.

A minta betöltése során a minta folyamatos keverése ajánlott a szedimentáció megelőzése érdekében. A minta 4°C-on történő betöltése növelheti a minta viszkozitását. A minta megnövekedett viszkozitásának kedvezőtlen hatása, hogy az oszlop maximális ellennyomása már kisebb mintatérfogat betöltése esetén is elérhető az oszlopon. A nagy térfogatok növelhetik az ellennyomást, ami a fecskendő használatát nehezebbé teszi.

1. Mosson kötőpufferrel, amíg az abszorbancia el nem éri az állandó alapvonalat (általában legalább 10-15 oszloptérfogat).
2. Elúciós pufferrel eluáljon lépcsős gradiens vagy lineáris gradiens alkalmazásával. Lépéses elúció esetén általában 5 oszloptérfogat elúciós puffer elegendő. Egy sekély gradiens, például 20 vagy több oszloptérfogaton átívelő lineáris gradiens elválaszthatja a hasonló kötőerősségű fehérjéket.
3. Elúció után regenerálja az oszlopot 5-10 oszloptérfogatnyi kötőpufferrel történő mosással. Az oszlop most már készen áll ugyanazon célfehérje újabb tisztítására.

Az oszlopot nem kell minden egyes tisztítás között lecsupaszítani és újratölteni, ha ugyanazt a fehérjét kívánjuk tisztítani. Bármely purifikációs oszlop újrafelhasználása a minta jellegétől függ, és a keresztkontamináció elkerülése érdekében csak azonos jelölésű fehérjékkel szabad elvégezni. A témával, valamint a tisztítással és tárolással kapcsolatos további információkért lásd 1. függelék (A Ni Sepharose, Ni Sepharose^® excel, TALON és TALON jellemzői)sup>® Superflow és a töltés nélküli IMAC Sepharose^® termékek).

A nem tisztított lizátumok fokozott légbuborékképződést okozhatnak a purifikáció során. A kromatográfiás rendszerben elhelyezett flow restrictorral ezt meg lehet akadályozni, ha ez problémát okoz. Ha flow restrictor van csatlakoztatva, fontos, hogy a nyomáshatárt  0,5 MPa (5 bar) értékre módosítsa az ÄKTA rendszeren (ahol az oszlop és a flow restrictor  0.3 MPa, illetve 0,2 MPa).

Ni Sepharose^® kompatibilis a redukálószerekkel. Javasoljuk azonban a gyengén kötött Ni²⁺ -ionok eltávolítását a redukálószereket tartalmazó puffer/minta alkalmazása előtt. Ez redukálószerek nélküli vakfuttatással érhető el (lásd alább). Ne hagyja vagy tárolja a HisTrap™ FF nyers oszlopokat redukálószereket tartalmazó pufferrel.

A Ni²⁺ -ból a Ni Sepharose^® -ból való szivárgás minden normális körülmények között alacsony. Nagyon kritikus alkalmazások esetén a tisztítás során történő szivárgás még tovább csökkenthető a minta betöltése előtt végzett vakfutással (az alábbiakban leírtak szerint).

Vakfutás:

Megkötő puffert és elúciós puffert használjon redukálószer nélkül.

1. Mossa át az oszlopot 5 térfogatnyi desztillált vízzel (a 20%-os etanol eltávolítása érdekében).
2. Mossa át 5 térfogatnyi elúciós pufferrel.
3. Kiegyenlítse 10 térfogatnyi kötőpufferrel az oszlopot.

Alkalmazási példák

1. Pichia pastorisban alacsony szinten expresszált hisztidin-jelölt fehérje tisztítása HisTrap™ FF crude használatával

HisTrap™ FF crude oszlopok kiválóan alkalmasak alacsony szinten expresszált hisztidin-jelzett fehérjék tisztítására olyan gazdaszervezetekből, mint a Pichia pastoris. A HisTrap™ FF nyers oszlopok használatával nagy tisztaságú fehérje nyerhető közvetlenül a P. pastoris nem klárifizett lizátjaiból.

3. ábra.16 egy hisztidin-jelölésű hidroláz tisztítását mutatja Saccharomyces cerevisiae -ből származó, alacsony szinten expresszált hidroláz tisztítását P. pastoris. Unclarified mintát közvetlenül egy HisTrap™ FF nyers 5 ml-es oszlopra töltöttük, a minta centrifugálása vagy filtrálása nélkül. A nem klarifizált mintából származó fehérje tisztasága SDS-PAGE-vel meghatározva magas volt.

3.16. ábra. (A) Saccharomyces cerevisiae-ből származó, P. pastorisban expresszált c a HisTrap™ FF nyers 5 mL-en. (B) SDS-PAGE nem redukáló körülmények között (ExcelGel SDS Gradient 8-18) mutatja az alacsony szintű expressziós fehérjéből kapott nagy tisztaságot.

2. Skálázás 1 ml-ről 5 ml HisTrap™ FF nyersanyagra

Egy kísérletet végeztünk az 1 ml-ről 5 ml HisTrap™ FF nyersanyag oszlopokra történő skálázásra. A minta MBP-(His)₆-t tartalmazó unclarified E. coli kivonat volt, amelyet az oszlopra töltés előtt homogenizálással kombinált enzimatikus lízissel állítottunk elő. A minták körülbelül 8 és 40 mg MBP-(His)₆ -t tartalmaztak az 1 ml-es, illetve az 5 ml-es oszlopok esetében.

A kromatográfiát követően (3.17A és 3.17B ábra) SDS-PAGE analízist végeztünk. Ez azt mutatja (3.17C ábra), hogy a két oszlopon tisztított hisztidin-taggal jelölt fehérje tisztasága és visszanyerése (mg fehérje/mL közeg) közel azonos volt.

3.17. ábra. A méretnövelés (A) 1 ml-es és (B) 5 ml-es HisTrap™ FF nyers oszlopokról. A fehérje visszanyerése 6,3 és 35,2 mg volt az 1 ml-es és az 5 ml-es oszlopok esetében. (C) SDS-PAGE nem redukáló körülmények között (ExcelGel SDS Gradient 8-18) konfirmálja, hogy az 1 mL-ről az 5 mL-es oszlopra történő skálázás nem befolyásolja jelentősen a tisztítási eredményt.

3. Automatizált, kétlépéses tisztítás a HisTrap™ FF crude használatával

A HisTrap™ FF crude oszlopok jól alkalmazhatók az ÄKTA-rendszereken, például az ÄKTAxpress-en történő futtatásra a hisztidin-címkézett fehérjék nagy áteresztőképességű tisztítására. Az ÄKTAxpress lehetővé teszi a hisztidin-címkézett fehérjék automatizált, párhuzamos tisztítását, számos különböző, többlépéses protokoll futtatásának képességével. Az UNICORN vezérlőszoftverhez mellékelt módszervarázsló segítségével könnyen létrehozhatók módszerek különböző purifikációs protokollokhoz. A 3.18. ábra egy MBP-(His)₆-t tartalmazó, nem klarifikált E. coli lizátum kétlépéses automatizált purifikációját mutatja. A tisztítási protokoll első lépése AC volt, a HisTrap™ FF nyers 1 mL-es oszlop használatával. Az affinity lépésből eluált csúcsot automatikusan összegyűjtöttük egy hurokba, és a purifikáció második lépésében egy HiLoad™ 16/60 Superdex 75 pg SEC-oszlopra visszaforgattuk. A SEC-lépésből származó frakciókban a fehérje tisztaságát SDS-PAGE segítségével konfirmáltuk (3.18B ábra).

Az eredmények azt mutatják, hogy a HisTrap™ FF crude az ÄKTAxpress-szel együtt megkönnyíti és jelentős időmegtakarítást tesz lehetővé a hisztidin-címkézett fehérjék tisztítása során, anélkül, hogy a minta tisztasága csökkenne.

3.18. ábra. (A) MBP-(His)6 automatizált kétlépéses tisztítása E. coli nem klárifizett lizátumból HisTrap™ FF crude és HiLoad 16/60 Superdex 75 pg segítségével ÄKTAxpressen. (B) Az SDS-PAGE-t nem redukáló körülmények között végeztük ExcelGel SDS Gradient 8-18-on.