Antitest-tisztítás Protein A/G/L agarózzal

Ezt a protokollt az antitestek gyors tisztítási módszerére tervezték emlősök szérumából, aszcitából és sejttenyésztési felülúszóból. Meg kell jegyezni, hogy ha a kiindulási anyag szérum vagy aszcitesz, a végső készítmény tartalmazni fog endogén gazdaszervezeti IgG-t és specifikus antitesteket is. Általánosságban elmondható, hogy az endogén IgG jelenléte nem zavarja az antitesteket használó vizsgálatokat. A több fajból származó normál szérumok és a monoklonális antitestforrások immunglobulin-tartalmát a Táblázat(PDF).

Megjegyzés: A fehérje A felhasználásával történő antitesttisztításhoz PURE1A Kit-et kínálunk.

Tisztítási protokoll
Reagensek és berendezések
Procedúra

Tisztítási protokoll (1 ml-es oszlophoz)

Megjegyzések: Ez a protokoll nagy molaritású, magas pH-jú töltőpuffert használ a Protein A számára, hogy fokozza a Protein A-hoz gyenge affinitással rendelkező alosztályok (mint például az egér IgG1) kötődését. A G és L fehérjékhez való kötődés semleges pH-n történik, ezért töltőpufferként foszfátpufferelt sóoldatot használunk. A kötött Ig eluálása egyetlen lépésben történik citrát pufferrel, pH 3, amely eltávolítja az összes, a gyantához kötött alosztályt. A Protein A és a Protein G különböző fajokból származó IgG-hez való kapacitása a Táblázat (PDF) című dokumentumban megadott relatív affinitások alapján becsülhető meg. Egy 1-2 pluszos IgG alosztály 1-5 mg IgG/ml gyantához kötődik. Egy 3-4 pluszos alosztály 10-25 mg/ml gyantához kötődik. Az L fehérje minden Ig-osztályt képes megkötni, és a 4 plusszal rendelkező fajok esetében 3-10 mg Ig-et képes megkötni mL gyantánként. Javasoljuk, hogy a használni kívánt gyanta legalább 2 pluszpontos legyen a tisztítandó anyag fajához és Ig-osztályához.

Reagensek és felszerelések

1. Serum, ascites vagy sejtkultúra felülúszó
2. Protein A betöltő puffer: 1 M kálium-foszfát, pH 9,0
3. Protein G vagy L töltőpuffer: 0,01 M foszfát pufferelt sóoldat (PBS), pH 7,4 (P4417 termékszám)
4. Elúciós puffer: 0,1 M citromsav, pH 3,0
5. 1,5 M Tris bázis, az eluátum semlegesítéséhez
6. 3 - 5 ml fecskendő (oszlophüvely), üveggyapot
7. Stopcock, Luer-Lock (termékszáma. S7396)
8. gyűrűs állvány, bilincs
9. Vizsgálati csövek, állvány
10. Spektrofotométer, küvetták
11. pH-mérő
12. Transzferpipetták, izzók
13. Poharak, keverőpálcák és keverőlap (pufferkészítéshez)
14. Szteril szűrőegységek (opcionális)
15. Nátrium-azid (tartósítószer) (termékszáma. S2002)
    

Művelet

1. Készítse elő a puffereket. A pufferek 4 °C-on 1-2 hétig tárolhatók. A steril szűrőegységeken keresztül történő szűrés meghosszabbítja a pufferek élettartamát, de nem szükséges.
2. Készítse elő az oszlophüvelyt. Távolítsa el a dugattyút a fecskendőből, és dobja el. Nyomjon egy kis mennyiségű üveggyapotot a fecskendő aljába, annyit, hogy kb. 1/2-1 cm vastag párnát képezzen. Csatlakoztassa a csapot. Öblítse ki 1-2 ml töltőpufferrel. Ügyeljen arra, hogy az üveggyapotpárna szilárdan a fecskendő alján maradjon.
3. Suszpendálja a gyantát 2 mL töltőpufferben a palack megfordításával és forgatásával. Kerülje a túlzott rázást. Ne örvényelje az iszapot.
4. Töltse az iszapot a fecskendőbe. Hagyja, hogy a felesleges puffer lefolyjon, majd mossa ki az oszlopot 5 mL töltőpufferrel. Ne hagyja, hogy a gyanta teljesen kiszáradjon.
5. Ha lehetséges, becsülje meg a betöltendő szérumban, aszciteszben vagy szupernátriumban lévő Ig mennyiségét. Ha az Ig mennyisége nem ismert, a Táblázat (PDF) tartalmazza a különböző fajokból származó szérumban, egér aszciteszben és sejtkultúra felülúszóban lévő Ig-ek hozzávetőleges szintjét, amely felhasználható a kiindulási anyagban lévő Ig mennyiségének becsléséhez. A kiindulási anyag fajának Ig-felvevő kapacitása (lásd a fenti megjegyzéseket) és a kiindulási anyagban lévő Ig mennyisége alapján számítsa ki a betöltendő térfogatot.
   
   Megjegyzés: Ezek hozzávetőleges értékek, amelyek csak kezdeti útmutatásként használhatók. A folyadékokban lévő tényleges Ig-koncentrációk és a gyantához való kötődés változó, és a kiindulási anyag és a gyanta optimális arányát kísérleti úton kell meghatározni.
   
   
   
6. A szérumot vagy aszciteszt 3 térfogatnyi töltőpufferrel hígítsuk fel. Hígítsa a felülúszót 1 térfogat töltőpufferrel.
7. A hígított anyagot vigye az oszlopra. Gyűjtse össze a nem kötött frakciót kémcsőbe vagy főzőpohárba, és tegye félre az esetleges újrafeldolgozáshoz. Mossa át a nem kötött fehérjéket 5 ml töltőpufferrel mL gyantánként.
8. Alkalmazza az Elúciós puffert az oszlopra. Gyűjtse össze az oszlop 1/2 térfogatának megfelelő frakciókat. Használjon 10 mL elúciós puffert mL gyantánként.
9. Kiegyenlítse újra az oszlopot 5 mL töltőpufferrel mL gyantánként. Ellenőrizze az eluátum pH-értékét, hogy az oszlop a töltőpuffer pH-értékének megfelelő egyensúlyba kerüljön.
10. Vizsgálja meg az eluátumfrakciókat fehérje szempontjából 280 nm-en történő abszorbanciával. (Kívánt esetben a vizuális meghatározás elvégezhető a Total Protein Kit segítségével.)
11. A fehérje szempontjából pozitív frakciókat össze kell gyűjteni. Semlegesítse pH 6-8-ra 1,5 M Tris bázissal.
12. Kívánság szerint a nem kötött frakciót újra fel lehet vinni az oszlopra, hogy visszanyerje az első áthaladáskor nem kötődő Ig-t, ami akkor fordulhat elő, ha a betöltött anyag mennyisége meghaladja az oszlop kapacitását.
13. Dializálja a kívánt pufferbe, pl. PBS, pH 7, 4 °C-on. A dialízispuffer térfogata legalább 20-szorosa legyen a fehérjeoldat térfogatának. Legalább 2 dialízispuffer-váltást kell végezni, egyenként legalább 2-4 órán keresztül, hogy a dialízispufferben való teljes egyensúlyozás biztosítva legyen.
14. Ha nem kell több futtatást végezni, mossuk az oszlopot 0,05-0,1% nátrium-azidot tartalmazó PBS-szel. Zárja le az oszlopot dugóval vagy parafóliával, és tárolja 4 °C-on.
    
    Megjegyzés: Ha szükséges, az egér és humán IgG izotípusok elválasztása lehetséges az A fehérjéből egy gradiens képző eszközzel (i.G6897), amely 0,1 M citrátpufferben lineáris pH-gradienst hoz létre pH 6,5 és pH 3,0 között. A teljes gradiens térfogatának legalább 10-szeresének kell lennie az oszlop térfogatának. Ennek az elúciós módszernek a hátránya, hogy több csúcsot eredményez, amelyek mindegyikét semlegesíteni és vizsgálni kell, és hogy sokkal hígabb terméket eredményez, mint az egylépéses elúció.