Mintaelőkészítés az ioncserélő kromatográfiában

Mintaelőkészítés

A kromatográfiás tisztításhoz használt mintáknak tisztának és részecskéktől mentesnek kell lenniük. A tisztítás megkezdése előtt a minta tisztítására irányuló egyszerű lépésekkel elkerülhető az oszlop eltömődése, csökkenthető a szigorú mosási eljárások szükségessége, és meghosszabbítható a kromatográfiás közeg élettartama.

A minta extrakciós eljárásokat, valamint a pufferek, adalékok és detergensek kiválasztását nagymértékben meghatározza az anyag forrása, a célmolekula stabilitása, az alkalmazott kromatográfiás technikák és a termék tervezett felhasználása. Ezekkel a témákkal általánosságban a Proteintisztítási kézikönyv és célmolekulánként specifikusabban a Protein tisztítási kézikönyv foglalkozik.a Rekombináns fehérjék kézikönyve, A fehérjeamplifikáció és egyszerű tisztítás és a Antitesttisztítási kézikönyv, a Cytivánál kapható.

Minta stabilitása

Az esetek többségében a biológiai aktivitást a tisztítás után is meg kell őrizni. A célmolekula aktivitásának megőrzése a tisztítás előrehaladásának követése során is előnyös, mivel a célmolekula kimutatása gyakran a biológiai aktivitásától függ. A mintakomponensek denaturációja gyakran vezet kicsapódáshoz vagy fokozott nem specifikus adszorpcióhoz, amelyek mindkettő rontja az oszlop működését. Ezért számos előnnyel jár a minta stabilitási határainak ellenőrzése és a tisztítás során e határok között való munkavégzés.

A fehérjék általában nagyfokú tercier szerkezetet tartalmaznak, amelyeket a van der Waals-erők, az ionos és hidrofób kölcsönhatások és a hidrogénkötések tartanak össze. Bármely olyan körülmény, amely képes ezeket az erőket destabilizálni, denaturációt és/vagy kicsapódást okozhat. Ezzel szemben a peptidek alacsony fokú tercier szerkezetet tartalmaznak. Natív állapotukban a másodlagos szerkezetek dominálnak, amelyeket főként hidrogénkötések stabilizálnak. Emiatt a peptidek sokkal szélesebb körű körülményeket tolerálnak, mint a fehérjék. A natív szerkezetek ezen alapvető különbsége abban is megmutatkozik, hogy a fehérjék nem könnyen renaturálódnak, míg a peptidek gyakran spontán renaturálódnak.

A tisztítási protokoll kidolgozásának megkezdése előtt célszerű stabilitási vizsgálatokat végezni. Az alábbi lista alapul szolgálhat az ilyen vizsgálatokhoz:

• Teszteljük a pH-stabilitást egy pH-egységnyi lépésben a pH 2 és a pH 9 között.
• Teszteljük a sóstabilitást 0-2 M NaCl és 0-2 M (NH4)2SO4 0,5 M lépésekben.
• Tesztelje a stabilitást acetonitrillel és metanollal szemben 10%-os lépésekben 0 és 50% között.
• Tesztelje a hőmérsékleti stabilitást +10 °C-os lépésekben +4 és +40 °C között.
• Tesztelje a stabilitást és a proteolitikus aktivitás előfordulását a minta egy aliquotjának szobahőmérsékleten való éjszakai hagyásával. Centrifugáljon minden mintát, és mérje meg az aktivitást és az UV-abszorbanciát 280 nm-en a felülúszóban.

Minta tisztítása

A centrifugálás és a szűrés a minták tisztításának standard laboratóriumi technikái, amelyeket rutinszerűen alkalmaznak kis minták kezelése során.

Kifejezetten ajánlott minden mintát közvetlenül a kromatográfiás tisztítás előtt centrifugálni és szűrni.

Centrifugálás

A centrifugálás eltávolítja a lipideket és a részecskéket, például a sejttörmeléket. Ha a minta a centrifugálás után sem tiszta, első lépésként használjon szűrőpapírt vagy 5 μm-es szűrőt, második lépésként pedig az alábbi szűrők valamelyikét.

• Kis mintamennyiségek vagy a szűrőkhöz adszorbeálódó fehérjék esetében centrifugáljon 10 000 g-n 15 percig.
• Sejtlizátumok esetében centrifugáljon 40 000-50 000 g-n 30 percig.
• A szérummintákat a centrifugálás után üveggyapoton keresztül lehet szűrni a visszamaradt lipidek eltávolítása érdekében.

Szűrés

A szűrés eltávolítja a részecskéket. A fehérjék nemspecifikus kötődését legkevésbé adó membránszűrők cellulóz-acetátból vagy PVDF-ből állnak.

A kromatográfia előtti mintaelőkészítéshez a szűrő pórusméretét a kromatográfiás közeg gyöngyszemméretéhez viszonyítva kell kiválasztani.

A szűrő névleges pórusmérete	A kromatográfiás közeg részecskemérete
1 μM	90 μM és felfelé
0.45 μM	30 vagy 34 μM
0.22 μM	3, 10, 15 μM vagy ha extra tiszta mintákra vagy steril szűrésre van szükség

Sótalanítás

A sótalanító oszlopok bármilyen mintamennyiséghez alkalmasak, és egyetlen lépésben gyorsan eltávolítják az alacsony molekulatömegű szennyeződéseket, miközben a mintát a megfelelő pufferfeltételekbe helyezik át. A minta centrifugálása és/vagy szűrése a sótalanítás előtt továbbra is ajánlott. A puffercserére és a sótalanításra vonatkozó részletes eljárások a 156. oldalon találhatók.

Laboratóriumi méretekben, ha a minták a szűrés vagy centrifugálás után meglehetősen tiszták, a puffercsere és a sótalanítási lépés elkerülhető. Affinitáskromatográfiához vagy hidrofób kölcsönhatáskromatográfiához elegendő lehet a minta pH-értékének beállítása, és szükség esetén hígítás az oldat ionerősségének csökkentése érdekében.

Kis vagy nagy mintamennyiségek gyors feldolgozása. Szükség esetén használja a tisztítási lépések előtt és/vagy között (ne feledje, hogy minden egyes további lépés csökkentheti a hozamot, és a sótalanítás is hígítja a mintát).

Eltávolítsa a sókat a Mr > 5 000 molekulatömegű fehérjékből.

Használjon 100 mM ammónium-acetátot vagy 100 mM ammónium-hidrogén-karbonátot, ha illékony pufferekre van szükség.

Specifikus mintaelőkészítési lépések

Specifikus mintaelőkészítési lépésekre lehet szükség, ha a nyers minta ismert, hogy olyan szennyeződéseket tartalmaz, mint például lipidek, lipoproteinek vagy fenolvörös, amelyek felhalmozódhatnak az oszlopon, vagy ha bizonyos durva szennyeződéseket, például ömlesztett fehérjét, el kell távolítani bármely kromatográfiás lépés előtt.

Frakcionált kicsapás

A frakcionált kicsapást gyakran alkalmazzák laboratóriumi léptékben a durva szennyeződések eltávolítására kis mintamennyiségekből, és alkalmanként kisüzemi termelésben is alkalmazzák. A kicsapási technikák a frakciókat a differenciális oldhatóság elve alapján választják el. Mivel a fehérjefajták hidrofóbságuk mértéke eltérő, a megnövelt sókoncentráció fokozhatja a hidrofób kölcsönhatásokat a fehérjék között, és csapadékkiválasztást okozhat. A frakcionált kicsapást három különböző módon lehet alkalmazni a durva szennyeződések eltávolítására, amint azt a 89. ábra mutatja.

89. ábra. A csapadék háromféleképpen használható.

A csapadékképző szerekre vonatkozó példákat a 15. táblázat tekinti át. Az ammónium-szulfátot használó legelterjedtebb kicsapási módszer részletesebb ismertetése következik.

15. táblázat Példák a csapadékkiválasztási technikákra

Szedőanyag	Típusos felhasználási feltételek		.Mintatípus	Kommentár
Ammónium-szulfát	Az alábbiakban leírtak szerint.	> 1 mg/ml fehérjék, különösen immuno-globulinok	Stabilizálja a fehérjéket, nem denaturálódik, a felülúszó közvetlenül a HIC-be mehet. Segít csökkenteni a lipidtartalmat.
Dextránsulfát	Adjunk hozzá 0.04 ml 10%-os dextrán-szulfátot és 1 mL 1 M CaCl2 per mL minta, 15 percig keverjük, 10 000 g centrifugálás, a pelletet dobjuk el.	Minták magas lipoproteinszinttel, pl. aszcitesz.	Lipoprotein kiválása.
Polyvinilpirrolidin	Adjunk hozzá 3%-ot (w/v), keverjük 4 órán át, centrifugáljuk 17 000 g-ra, dobjuk el a pelletet.	Minták magas lipoproteinszinttel, pl. aszcitesz.	A dextránsulfát alternatívája.
Polietilénglikol (PEG, Mr > 4000)	Még 20 % w/vol-ig	Plazmafehérjék.	Nem denaturálódik, a felülúszó közvetlenül az IEX-be vagy AC-be kerül, a teljes eltávolítás nehéz lehet. Stabilizálja a fehérjéket.
Aceton (hideg)	Még 80 % térfogat/vol +0 °C-on. Gyűjtse össze a pelletet Eppendorf™ centrifugában teljes fordulatszámon történő centrifugálás után.		A fehérjéket irreverzibilisen denaturálhatja. Hasznos a peptidek kicsapásához vagy a minta koncentrálásához az elektroforézishez.
Polietilénimin	0.1% w/v		Az aggregált nukleoproteinek kicsapása.
Protamin-szulfát		1% w/v		Az aggregált nukleoproteinek kicsapódása
Streptomicin-szulfát	1% w/v		Nukleinsavak kicsapása.
Kaprilsav	(X/15) g, ahol X = a minta térfogata.	Az antitest koncentrációja legyen > 1 mg/ml.	A fehérjék nagy részét kivonja a szérumból vagy aszcitából, az immunglobulinokat oldatban hagyja.

A részletek a következő forrásból származnak:

Scopes R.K., Protein Purification, Principles and Practice, Springer, (1994), J.C. Janson and L. Rydén, Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications, 2nd ed. Wiley Inc, (1998). Személyes közlések.

Ammónium-szulfátos kicsapás

Egyes fehérjéket károsíthat az ammónium-szulfát. Vigyázzunk a kristályos ammónium-szulfát hozzáadásakor: a magas helyi koncentrációk a csapadék nem kívánt fehérjékkel való szennyeződését okozhatják.

Rutinszerű, reprodukálható tisztítás esetén a kromatográfia javára kerülni kell az ammónium-szulfáttal történő kicsapást.

A kicsapás általában ritkán hatékony 1 mg/ml alatti fehérjekoncentráció esetén.

A kicsapáshoz szükséges oldatok:

Telített ammónium-szulfát oldat (100 ml desztillált vízhez adjunk 100 g ammónium-szulfátot, keverjük meg, hogy feloldódjon).

1 M Tris-HCl, pH 8,0.

Puffer az első tisztítási lépéshez.

1. Szűrjük (0,45 μM) vagy centrifugáljuk a mintát (10 000 g +4 °C-on).
2. Adjunk 1 rész 1 M Tris-HCl, pH 8,0-t 10 rész mintatérfogathoz a pH fenntartásához.
3. Keverjük óvatosan. Adjunk hozzá ammónium-szulfát oldatot, cseppenként. Adjunk hozzá 50%-os telítettségig*. Keverjük 1 órán át.
4. Centrifugáljuk 20 percig 10 000 g-n.
5. Vegyük ki a felülúszót. Mossuk ki a pelletet kétszer azonos koncentrációjú ammónium-szulfát-oldatban történő újraszuszpendálással (azaz olyan oldatban, amely nem oldja fel újra a kicsapódott fehérjét, és nem okoz további kicsapódást). Centrifugáljuk újra.
6. Oldjuk fel a pelletet egy kis térfogatban a következő lépéshez használandó pufferben.
7. Az ammónium-szulfátot a Sephadex G-25-tel végzett tisztítási/puffercsere lépések során sótalanító oszlopok segítségével távolítjuk el.

*A telítettség %-ot vagy a célmolekula kicsapásához, vagy a szennyező anyagok kicsapásához lehet beállítani.

Az adott telítettségi fok eléréséhez szükséges ammónium-szulfát mennyisége a hőmérséklet függvényében változik. A 16. táblázat a +20 °C-on szükséges mennyiségeket mutatja.

16. táblázat. Az adott telítettségi fok eléréséhez szükséges ammónium-szulfát mennyiségek +20 °C-on.

nbsp;                                         Véglegesen elérendő százalékos telítettség
	20	25	30	30	35	40	45	50	40	45	50	55	60	65	65	70	75	80	85	75	80	85	90	95	100
Kezdési százalékos telítettség	Az adandó ammónium-szulfát mennyisége (gramm) literenként +20 oC
0	113		144	176	208	242	277	314	351	390	430	472	516	561	608	657	608	657	708	761
5	85	115	146	115	146	179	212	246	212	246	282	319	358	397	439	481	526	526	572	621	671	723
10	57	86	117	149	182	216	251	287	325	364	405	447	491	537	584	634	685
15	28	58	88	88	119	151	185	219	255	293	331	331	371	413	456	501	548	596	647	647
20	0	29	59	89	121	154	188	223	260	298	337	378	337	378	421	465	511	559	609
25		0	29	60	91	123	157	191	228	265	304	344	386	429	475	522	571	522	571
30			0	30	61	92	125	160	195	232	270	309	351	393	438	393	393	438	485	533
35				0	30	62	94	128	163	199	236	275	316	316	358	402	447	495
40					0	31	63	96	130	166	202	166	241	281	322	322	365	410	457
410	457
45						0	31	64	98	132	169	206	206	245	286	329	373	419
50								0	32	65	99	135	172	210	250	292	335	381
55										0	33	66	66	101	138	175	215	256	298	343
60									0	33	67	103	140	179	179	219	261	305
65										0	34	69	105	143	183	224	267
70											0	34	70	107	146	146	186	228
75																0	35	72	110	10	149	190
80																	0	36	73	73	112	152
85														0	37	37	75	114
90																			0	37	76
95																0	38

A fehérjecsapadékok reszolubilizálása

Sok fehérje könnyen reszolubilizálható a következő kromatográfiás lépésben felhasználandó puffer kis mennyiségében. A kevésbé oldódó fehérjék esetében azonban denaturáló szerre lehet szükség. A konkrét feltételek a konkrét fehérjétől függnek. Ezeket a szereket mindig el kell távolítani, hogy lehetővé váljon a fehérje teljes visszaalakítása, valamint a tömeg és az aktivitás maximális visszanyerése. A kromatográfiás lépés gyakran eltávolítja a denaturálószert a tisztítás során. A 17. táblázat példákat mutat be a leggyakoribb denaturáló szerekre.

17. táblázat

Denaturálószer	Típusos felhasználási feltételek
Karbamid	2 M-8 M	Sephadex G-25 segítségével távolítsuk el.
Guanidin-hidroklorid	3 M-6 M	Sephadex G-25 segítségével vagy az IEX során eltávolítani.
Triton X-100	2%	Sephadex G-25 segítségével vagy az IEX során eltávolítani.
Sarcosyl	1.50%	Sephadex G-25 használatával vagy az IEX során eltávolítani.
N-oktilglükozid	2%	Sephadex G-25 használatával vagy az IEX során eltávolítani.
Nátrium-dodecil-szulfát	0,1%-0.5%		Az első kromatográfiás lépés során cserélje ki nem ionos detergensre, kerülje az anioncserélő kromatográfiát.
Alkalikus pH	> pH 9, NaOH		Az oldhatóság fenntartása érdekében a kromatográfia során szükség lehet a pH beállítására.

A részletek a:

Scopes R.K., Protein Purification, Principles and Practice, Springer, (1994), J.C. Janson and L. Rydén, Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications, 2nd ed. Wiley Inc, (1998) és más forrásokból.

Puffercsere és sótalanítás

A szakirodalomban gyakran említik a dialízist, mint a só vagy más kismolekulák eltávolítására és a minta pufferösszetételének cseréjére szolgáló technikát. A dialízis azonban általában nagyon lassú technika, és nagy mennyiségű puffert igényel. A kezelés során, illetve a proteolitikus lebontás vagy a dialízismembránokhoz való nem specifikus kötődés következtében fennáll az anyagvesztés veszélye. Egyszerűbb és sokkal gyorsabb technika a Sephadex G-25-össel töltött sótalanító oszlop használata a nagy és kis molekulatömegű anyagok csoportos elválasztására. A fehérjéket elválasztjuk a sóktól és más kis molekuláktól.

Egy gyors, egyetlen lépésben a mintát sótalanítjuk, új pufferbe helyezzük át, és eltávolítjuk az alacsony molekulatömegű anyagokat.

A sótalanító oszlopok nemcsak az alacsony molekulatömegű szennyező anyagok, például a só eltávolítására szolgálnak, hanem a különböző kromatográfiás lépések előtt vagy után puffercserére, valamint a reagensek gyors eltávolítására a reakció befejezéséhez is.

A sótalanító oszlop teljes térfogatának akár 30%-át kitevő mintamennyiségek is feldolgozhatók. A mintakoncentráció nem befolyásolja az elválasztást, amennyiben a fehérjék koncentrációja nem haladja meg a 70 mg/ml-t normál vizes pufferek használata esetén. A mintának teljesen fel kell oldódnia. A részecskés anyag eltávolításához centrifugáljon vagy szűrje le.

Kisebb mintamennyiségek esetén lehetséges a minta hígítása a kromatográfiás tisztításhoz használandó kiindulási pufferrel, de a sejttörmeléket és a részecskéket így is el kell távolítani.

Az esetleges ionos kölcsönhatások megelőzése érdekében a sótalanítás során és a végső mintapufferben alacsony sókoncentráció (25 mM NaCl) jelenléte ajánlott.

Az illékony pufferek, például 100 mM ammónium-acetát vagy 100 mM ammónium-hidrogén-karbonát használható, ha a NaCl jelenlétét el kell kerülni.

A 90. ábra egy tipikus puffercsere és sótalanítás elválasztását mutatja. A folyamat az UV-abszorpció és a vezetőképesség változásainak követésével nyomon követhető.

90. ábra. Egérplazma (10 ml) puffercseréje HiPrep™ 26/10 sótalanítással.

Laboratóriumi méretű műveletekhez a 18. táblázat az előrecsomagolt, használatra kész sótalanító és puffercserélő oszlopok kiválasztási útmutatóját tartalmazza.

18. táblázat Kiválasztási útmutató a sótalanításhoz és a puffercseréhez.

Szlop	Mintamennyiség		Minta elúciós térfogata
MicroSpin™ G-25	0.1-0,15 ml	0,1-0-0.15 ml
PD-10 (gravitációs táposzlop)	1,5-2,5 ml	2.5-3,5 ml
HiTrap® sótalanítás 5 ml	0.25-1,5 mL	1,0-2.0 ml
HiPrep™ 26/10 sótalanítás	2.5-15 ml	7,5-20 ml

Nagyobb mintamennyiségek sótalanításához:

- akár 5 HiTrap^® 5 ml-es sótalanító oszlopot csatlakoztathat egymás után a mintatérfogat kapacitásának növeléséhez, pl. 2 oszlop: 3 mL mintatérfogat, 5 oszlop: 7,5 mL mintatérfogat.

- akár 4 HiPrep™ 26/10 sótalanító oszlopot csatlakoztathat egymás után a nagyobb mintatérfogat-kapacitás növeléséhez, pl. 2 oszlop: 30 mL mintatérfogat, 4 oszlop: 60 mL mintatérfogat. Még 4 oszlop sorba kapcsolásával is 20-30 perc alatt feldolgozható a minta, szobahőmérsékleten, vizes pufferben.

Minden oszlophoz útmutatót mellékelünk. A sótalanítás és a puffercsere kevesebb mint 5 percet vesz igénybe mintánként, a legtöbb fehérje esetében 95%-nál nagyobb visszanyerés mellett.

1. alternatíva: Kézi sótalanítás HiTrap^® HiTrap^® 5 mL sótalanítás fecskendővel

1. Töltse meg a fecskendőt pufferrel. Távolítsa el a dugót. A levegő oszlopba történő bevezetésének elkerülése érdekében csatlakoztassa az oszlopot "cseppről cseppre" a fecskendőhöz (a mellékelt adapteren keresztül).
2. Vegye ki a lecsavarható véget.
3. Mossa az oszlopot 25 ml pufferrel 5 ml/perc sebességgel, hogy teljesen eltávolítsa a 20%-os etanolt (tárolási pufferként mellékelt). Ha levegő rekedt az oszlopban, mosson gáztalanított pufferrel, amíg a levegő el nem tűnik. A minta felvitele során véletlenül az oszlopra került légbuborékok nem befolyásolják az elválasztást.
4. A mintát 2-5 ml-es fecskendővel, 1-10 ml/perc közötti áramlási sebességgel vigye fel. Dobja el az oszlopról eluált folyadékot.
5. Ha a minta térfogata kevesebb, mint 1,5 mL, váltson pufferre, és folytassa az injektálást, amíg összesen 1,5 mL nem eluálódik. Dobja el az eluált folyadékot.
6. Elutálja a fehérjét a 19. táblázatból kiválasztott megfelelő térfogattal. Gyűjtse össze a sótalanított fehérjét a feltüntetett térfogatban.

Megjegyzés: 5 ml/perc körülbelül 120 csepp/percnek felel meg, ha HiTrap^® 5 ml-es oszlopot használ. Egy egyszerű perisztaltikus szivattyú is használható a minta és a pufferek adagolására.

A maximális ajánlott mintatérfogat 1,5 ml. Az oszlopra felvitt mintamennyiség csökkentésének hatását a 19. táblázat tartalmazza.

19. táblázat Ajánlott minta- és elúciós térfogatok fecskendő vagy Multipipette™ használatával.

Mintatöltés mL	Adjunk hozzá puffert mL	Elhígítsuk és gyűjtsük össze mL	Kihozatal %	Maradék só %	Hígítási tényező
0.25	1.25	1.0	> 95		0.0	4.0
0.50	1.0	1.5	> 95	< 0.1	3.0
1.00	0.5	2.0	> 95	< 0.2	2.0
1.50	0	2.0	> 95	< 0.2	1.3

Egy egyszerű perisztaltikus szivattyú is használható a minta és a pufferek felvitelére.

Alternatíva 2: Egyszerű sótalanítás az ÄKTAprime™ segítségével

Az ÄKTAprime™ előre programozott sablonokat tartalmaz az egyes HiTrap^® 5 ml-es és HiPrep™ 26/10 sótalanító oszlopokhoz.

Puffer előkészítése

Készítsen elő legalább 500 ml-t a szükséges pufferből.

1. Az oszlop csatlakoztatásához és a rendszer pufferrel való feltöltéséhez kövesse az ÄKTAprime™ segédkártyán található utasításokat.
2. Válassza ki az Alkalmazássablont.
3. Indítsa el a módszert.
4. Adja meg a minta térfogatát, és nyomja meg az OK gombot.

A 91. ábra. egy tipikus, az ÄKTAprime™ segítségével kapott eredményt mutat. Az UV (fehérje) és a vezetőképesség (só) nyomok lehetővé teszik a sótalanított frakciók összevonását.

91. ábra. Egy (His)6 fúziós fehérje sótalanítása ÄKTAprime™-on.

Lipoproteinek eltávolítása

A lipoproteinek és más lipidanyagok gyorsan eltömíthetik a kromatográfiás oszlopokat, ezért célszerű eltávolítani őket a tisztítás megkezdése előtt. A nagy mennyiségű lipoprotein eltávolítására az olyan mintákból, mint például az aszcitikus folyadék, a frakcionált kicsapásnál leírt kicsapószerek, mint a dextrán-szulfát és a polivinil-pirrolidin, ajánlottak.

A célmolekula szűrőhöz való nem specifikus kötődésének kockázatát elkerülendő, a mintákat centrifugálni kell.

A mintákat, például a szérumot üveggyapoton keresztül lehet szűrni a maradék lipidek eltávolítása érdekében.

Fenolvörös eltávolítása

A fenolvöröset laboratóriumi méretekben gyakran használják pH-indikátorként sejtkultúrákban. Bár közvetlenül nem zavarja a tisztítást, a fenolvörös kötődhet bizonyos tisztítóközegekhez, ezért a szennyeződés kockázatának elkerülése érdekében a lehető legkorábban el kell távolítani. Ismert, hogy pH > 7 pH-nál kötődik az anioncserélő közegekhez.

A fenolvörös (alacsony molekulatömegű molekula) egyidejű eltávolítására és a minta megfelelő pufferfeltételek közé történő átvitelére a további tisztításhoz egy sótalanító oszlopot használjon, a Puffercsere és sótalanítás című fejezetben leírtak szerint.

A kis molekulatömegű szennyezőanyagok eltávolítása

Ha a minták nagy mennyiségű kis molekulatömegű szennyezőanyagot tartalmaznak, az első kromatográfiás tisztítási lépés előtt használjon sótalanító oszlopot a puffercsere és sótalanítás című fejezetben leírtak szerint.