Použití imortalizovaných buněčných linií 16HBE14- lidských bronchiálních epitelů k modelování plicních onemocnění

• Co jsou to buňky 16HBE14o-?
• Sbírka buněčných linií lidských plicních epitelů
• Buněčné 3D kultury s rozhraním vzduch-kapalina (ALI)
• Tipy &; triky pro provádění 16HBE14o- ALI pomocí stojících vložek pro buněčné kultury Millicell^®
• .Buněčný model cystické fibrózy a funkce CFTR
• Mechanismy virových onemocnění dýchacích cest (H1N1, SARS-CoV, COVID-19)
• Výzkum astmatu a CHOPN
• Expozice znečištěnému ovzduší
• Vliv kouření a vapingu na funkci plic

Obrázek 1. Buněčná linie 16HBE14o- je vhodným modelem pro studium molekulárních mechanismů, který si zachovává charakteristické rysy normálních diferencovaných bronchiálních epiteliálních buněk.

Co jsou 16HBE14o-buňky?

Bronchiální epitelové buňky tvoří funkční bariéru podél hlavních průchodů do plic a představují kritickou obrannou linii proti respiračním patogenům. Pro pochopení interakce mezi respiračními chorobami a epiteliálními buňkami jsou nezbytné fyziologické modely. Primární buňky a buněčné linie kultivované na rozhraní vzduch-kapalina (ALI) věrně reprezentují nativní buňky a zachovávají klíčové vlastnosti epitelu dýchacích cest in vivo, na který se viry zaměřují.

Lidská bronchiální epiteliální buněčná linie 16HBE14o- (SCC150) byla izolována z průdušek pacienta se srdečním selháním a imortalizována pomocí pSVori-, plazmidu SV40 s defektním původem replikace. Tato buněčná linie je vhodným modelem pro studium molekulárních mechanismů a exprimuje vysoké hladiny mRNA a proteinu regulátoru transmembránového vedení cystické fibrózy (CFTR). 16HBE14o- si zachovává vlastnosti normálních diferencovaných bronchiálních epiteliálních buněk, včetně:

• Morfologie dlaždicového tvaru
• Exprese cytokeratinu
• Schopnost vytvářet těsné spoje (TJ)
• Výrazné vlastnosti bakterií, které se vyznačují např.Směrový transport iontů
• Schopnost vytvářet transepiteliální elektrický odpor (TEER)
• Funkční řasinky detekovatelné při kultivaci v ALI

Sbírka lidských plicních epiteliálních buněčných linií

Nabízíme kompletní sbírku lidských plicních epiteliálních buněčných linií licencovaných Gruenertovou laboratoří a umístěných ve Výzkumném centru NIH pro cystickou fibrózu na Kalifornské univerzitě v San Franciscu. Tyto rozsáhle publikované lidské buněčné linie jsou cennými modely plicních onemocnění, jako je cystická fibróza, astma, chronická obstrukční plicní nemoc (CHOPN) a rakovina plic. Poskytují také relevantní in vitro modely pro výzkum důsledků vystavení znečištěnému ovzduší, kouření a vapingu a modelování respiračních virových infekcí, jako je chřipka H1N1, SARS-CoV, MERS-CoV a COVID-19.

Název buněčné linie	Tkáň původu	Genotyp CFTR	Publikace
16HBE14o- (SCC150)	Bronchi	Wt/Wt	Reference
1HAEo- (SCC152)	Trachea/Bronchi	Wt/Wt	Reference
9HTEo- (SCC153)	Trachea	Wt/Wt	Reference
56FHTE8o-& (SCC154)	Trachea	Wt/Wt	Reference
6CFSMEo- (SCC157)	Podslizniční žláza	dF508/Q2X	Reference
CFSMEo- (SCC155)	Podslizniční žláza	dF508/Q2X	Reference
CFTE29o- (SCC162)	Trachea	dF508/dF508	Reference
CFBE41o- (SCC151)	Bronchi	dF508/dF508	Reference
CFBE41o/CFTR 4.7N (SCC158)	Bronchi	dF508/dF508 transfekce Wt	Reference
CFBE41o-/CFTR DeltaF4.7 (SCC159)	Bronchi	dF508/dF508 transfekce dF508	Reference

Buněčné kultury 3D rozhraní vzduch-kapalina (ALI)

Techniky buněčných kultur 3D rozhraní vzduch-kapalina (ALI) podporují diferenciaci lidských bronchiálních epiteliálních buněk do zralých plicních fenotypů z buněčných linií, jako je 16HBE14o-. Bronchiální epiteliální buňky kultivované pomocí technik buněčných kultur ALI mohou vytvářet polarizované buněčné vrstvy a těsné spoje, mohou se diferencovat a vykazovat funkční řasinky. Metody kultivace buněk ALI se opírají o vložky buněčných kultur Millicell^® podporující vývoj pseudostratifikovaného mukociliárního fenotypu pozorovaného in vivo. 16HBE14o- ALI Reference

Obrázek 2. Epitelové buňky dýchacích cest kultivované v tradičním 2D (vlevo) vs. 3D rozhraní vzduch-kapalina (ALI) (vpravo). V tradiční 2D kultuře se kultivační médium přidává na buňky, takže nejsou vystaveny působení vzduchu. Při 3D ALI kultivaci jsou buňky kultivovány na vložkách a pouze bazální povrch je vystaven médiu, zatímco apikální strana je vystavena vzduchu, aby lépe reprezentovala strukturu in vivo.

Protokol kultivace buněk na rozhraní vzduch-kapalina

1. Naplňte baňky pro tkáňové kultury směsí ECM:
   • Fibronektin (FN) (10 μg/ml, F2006)
   • Kolagen (30 μg/ml, 5006)
   • BSA (100 μg/mL 126575)
   Kultivace a expanze 16HBE14o- buněk na baňkách potažených ECM v ∝-MEM (M2279), 10% FBS (ES-009-B), 2 mM L-Glutamin (TMS-002-C) a 1X roztok penicilinu a treptomycinu (TMS-AB2-C). Nedovolte, aby se buňky staly nadměrně konfluentními, a rozdělte je po dosažení 90-95% konfluence. Odstraňte adherované buňky pomocí roztoku trypsinu-EDTA (T3924).
2. Buňky 16HBE14o- nasaďte do vložky pro závěsné buněčné kultury Millicell^® (PTHT12H48) v hustotě 10⁵ buněk/cm² v 1-2 ml expanzního média uvedeného v kroku 1 výše. Buňky ponořte na 24 hodin do inkubátoru při 37 °C. Pro protkoly používající stojaté vložky Millicell^®  viz Tipy &; triky níže.
3. Začněte kultivaci na rozhraní vzduch-kapalina přenesením kultivační vložky/buněk do nové 12jamkové destičky (CLS353043). Celé kultivační médium uvnitř vložky lze odstranit, čímž se buňky vystaví působení vzduchu. Každý den vyměňte médium na bazolaterální straně vložky.
4. Osmý den nebo po něm lze buňky analyzovat pomocí běžných buněčných testů nebo barvení protilátkami.

Obrázek 3. ALI kultivace lidských bronchiálních epiteliálních buněk 16HBE14-. 16HBE14o- buňky vykazují polaritu (modrá), intracelulární těsné spoje ZO-1 (červená, AB2272) a apikální expresi CFTR (zelená, MAB3484) s funkcí epiteliální bariéry při kultivaci na rozhraní vzduch-kapalina (ALI) (červeně a modře).

Tipy a triky pro provedení 16HBE14o- ALI pomocí stojících vložek pro buněčné kultury Millicell^®

Tento protokol lze provést také na stojících vložkách pro buněčné kultury Millicell^®. Vložka s polykarbonátovou membránou o délce 0,4 m (PIHP01250) je opticky průsvitná, ale buňky lze zobrazit vyjmutím membrány z vložky pomocí čidla. 11 skalpelem. Hydrofilní membrána z PTFE o tloušťce 0,4 µm (PICM01250) je opticky průhledná a lze ji zobrazovat přímo z vložky.

1. Den před výsevem buněk umístěte stojaté vložky Millicell^® do 24jamkových destiček Falcon^® pro kultivaci buněk (CLS353047) a pokryjte apikální stranu membrány (PIHP01250) 150 µl směsi ECM. Pro hydrofilní PTFE membrány (PICM01250) doporučujeme použít 60 µl ředěný kolagen (směs kolagenu a ethanolu).
2. Vložte potažené destičky do nové 24jamkové destičky a na apikální stranu nasaďte 200 μl buněk 16HBE14o- (1,33 x10⁵ buněk/cm²). Na bazolaterální stranu přidejte 400 μl média. Následující den přidejte na apikální stranu dalších 200 µl média.
   Poznámka: Doporučujeme používat Millicell^® DCI. ke sledování růstu buněk na průhledné PTFE membráně (PICM01250) v prvních 4 dnech kultivace buněk. Před zahájením ALI je třeba pozorovat plné pokrytí. 
3. Čtyři dny po nasazení buněk zahajte den 0 ALI odebráním média z apikální strany a vystavením buněk vzduchu. Zmenšete objem bazolaterálního média na 250 µl, abyste zabránili vznášení.
4. Vyměňujte bazolaterální médium každý druhý den až po dobu 14 dnů.
5. Měřte TEER každý druhý den počínaje dnem 0 ALI. Fixujte buňky 4% formaldehydem (47608) pro konfokální zobrazování a imunobarvení 1., 8. a 14. den ALI. Proveďte testy propustnosti luciferové žluti (LY) ve dnech 0, 8 a 14 ALI. Pro měření TEER a provedení testů LY umístěte vložky do nové 24jamkové destičky a přidejte čerstvé médium o pokojové teplotě:Pro TEER přidejte 400 µl média na apikální stranu a 600 µl na bazolaterální stranu. Nejlepší je měřit TEER co nejdříve po přidání apikálního objemu.
6. Pro testy LY přidejte 400 µl média na apikální stranu a 400 µl na bazolaterální stranu. 

Buněčný model cystické fibrózy a funkce CFTR

Cystická fibróza je dědičné onemocnění postihující více orgánových systémů, včetně plic a trávicí soustavy. Toto onemocnění je charakterizováno abnormalitami ve žlázách produkujících hlen, což vede k tomu, že sekrety narušují dýchací cesty hustým a lepkavým hlenem, který ucpává plíce a může vést až ke smrti. Protein CFTR (cystická fibróza - cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) pomáhá udržovat rovnováhu soli a vody v těle, včetně povrchu plic. Mutace nebo absence genu CFTR mohou vést k cystické fibróze.

Buněčná linie 16HBE14o- (SCC150) je buněčná linie epitelu dýchacích cest divokého typu a exprimuje vysoké hladiny mRNA a proteinu CFTR. Rodičovská buněčná linie CFBE41o- (SCC151) je odvozena od pacienta s CF homozygotního pro mutaci ΔF508 CFTR. Následné klony této linie byly vytvořeny s opravenou mutací ΔF508 CFTR (SCC158-SCC161).

Andersson C, Al-Turkmani MR, Savaille JE, Alturkmani R, Katrangi W, et al. 2008. Modely buněčných kultur ukazují, že dysfunkce CFTR vede k defektnímu složení a metabolismu mastných kyselin. J Lipid Res. 49(8):1692-700

Muir A, Soong G, Sokol S, Reddy B, Gomez MI, et al. 2004. Toll-like receptory v normálních buňkách epitelu dýchacích cest a buňkách epitelu cystické fibrózy. Am J Respir Cell Mol Biol. 30(6):777-83.

Luciani A, Villella VR, Esposito S, Brunetti-Pierri N, Medina D, et al. 2010. Defekt CFTR indukuje tvorbu aggresomů a zánět plic u cystické fibrózy prostřednictvím inhibice autofagie zprostředkované ROS. Nat Cell Biol. 12(9):863-75.

16HBE14o- Cystická fibróza Reference

Cytokeratin 18

Pancytokeratin

Těsné spoje ZO-1

CFTR (WT)

Obrázek 4. Charakterizace protilátek buněčné linie 16HBE14o-. Zleva doprava: Buňky 16HBE14o- exprimují klíčové plicní epiteliální markery cytokeratin 18, pan-cytokeratin (zeleně, MAB3412), vytvářejí těsné spoje, jak dokazuje TJ protein ZO-1 (červený, AB2272) a exprimují divoký typ CFTR (zelený, MAB3484).

Obrázek 5. Exprese genů CFTR u buněčných linií bronchiálního epitelu. Buňky 16HBE14o- exprimují CFTR divokého typu, zatímco CFBE41o- a 1HAEo- expresi genu CFTR postrádají. Buněčné linie CFBE41o- jsou odvozeny od pacienta s cystickou fibrózou, který neexprimuje divoký typ CFTR. Byly vytvořeny čtyři klony s opravenou mutací (4.7N, delta F4.7, 6.2N a delta F6.2).

Mchanismy respiračních virových onemocnění (H1N1, SARS-CoV, COVID-19)

Bronchiální epitelové buňky tvoří funkční bariéru podél hlavních průchodů do plic a představují kritickou obrannou linii proti respiračním patogenům (včetně chřipky H1N1, SARS-CoV, MERS-CoV, RSV a COVID-19). Buněčná linie 16HBE14o- byla použita ke studiu a charakterizaci mnoha mechanismů virové infekce na podporu výzkumu pro vývoj vakcín a léků. Buňky 16HBE14o- například exprimují angiotenzin konvertující enzym 2 (ACE2) a serinovou proteázu TMPRSS2, které hrají zásadní roli při infekci SARS-CoV a replikaci viru.

Kam YW, Okumura Y, Kido H, Ng LF, Bruzzone R, Altmeyer R. 2009. Štěpení hrotového glykoproteinu koronaviru SARS proteázami dýchacích cest zvyšuje vstup viru do lidských bronchiálních epiteliálních buněk in vitro. PLoS One. 4(11):e7870.2

Wu XL, Ju DH, Chen J, Yu B, Liu KL, He JX, et al. 2003. Imunologický mechanismus pačuliového alkoholu proti viru chřipky H1N1 může prostřednictvím regulace signální dráhy RLH in vitro. Curr Microbiol. 67(4):431-6.

Qin L, Peng D, Hu C, Xiang Y, Zhou Y, et al. 2014. Diferenciace podskupin Th inhibovaných nestrukturálními proteiny respiračního syncytiálního viru je zprostředkována ubikvitinací. PLoS One. 9(7):e101469.

16HBE14o- Odkazy na viry

ACE2 DAPI

TMPRSS2 DAPI

Obrázek 6. Buňky 16HBE exprimují ACE-2 a TMPRSS2. Zleva doprava: Buňky 16HBE14o- kultivované technikou vzduch-kapalina-interface (ALI) po dobu 8 dnů vykazují expresi angiotenzin konvertujícího enzymu 2 (ACE2) a serinové proteázy TMPRSS2, které hrají zásadní roli při infekci SARS-CoV (COVID-19) a replikaci viru.

Buněčné modely pro výzkum astmatu a CHOPN

Bronchiální astma a chronická obstrukční plicní nemoc (CHOPN) jsou obstrukční plicní onemocnění charakterizovaná základním zánětem dýchacích cest, který může vést k dýchacím obtížím, nadprodukci hlenu a poškození plic. Buněčné linie 16HBE14o- byly použity v buněčných modelech ke studiu náboru zánětlivých buněk, jejich aktivace a základních mechanismů při studiu plicního astmatu a CHOPN.

Hackett TL, de Bruin HG, Shaheen F, van den Berge M, van Oosterhout AJ, et al. 2013. Caveolin-1 řídí funkci epitelové bariéry dýchacích cest. Důsledky pro astma. Am J Respir Cell Mol Biol. 49(4):662-71.

Leino MS, Loxham M, Blume C, Swindle EJ, Jayasekera NP, et al. 2013. Barrier disrupting effects of Alternaria alternata extract on bronchial epithelium from asthmatic donors. PLoS One. 8(8):e71278.

Pace E, Ferraro M, Minervini MI, Vitulo P, Pipitone L, et al. 2012. Beta defensin-2 je snížen v centrálních, ale nikoliv v distálních dýchacích cestách kuřáků s CHOPN. PLoS One. 7(3):e33601.

16HBE14o- Astma/COPD Reference

Expozice znečištěnému ovzduší

Expozice toxickým látkám znečišťujícím ovzduší, jako je ozón (O3), benzeny a oxid dusičitý (NO2) z výfukových plynů vozidel a spalování zkapalněného ropného plynu, hraje důležitou roli při vzniku alergických onemocnění dýchacích cest a rakoviny plic. Buněčné linie 16HBE14o- byly použity v buněčných modelech ke studiu škodlivých účinků znečištění ovzduší na lidský bronchiální epitel.

Jiang CL, He SW, Zhang YD, Duan HX, Huang T, et al. 2017. Znečištění ovzduší a změny metylace DNA u rakoviny plic: A systematic and comparative study. Oncotarget. 8(1):1369-1391

Zhou Z, Liu Y, Duan F, Qin M, Wu F, et al. 2015. Transkriptomické analýzy biologických účinků expozice částicím PM2,5 v ovzduší na lidské bronchiální epitelové buňky. PLoS One. 10(9):e0138267.

Marano F, Boland S, Bonvallot V, Baulig A, Baeza-Squiban A. 2002. Epitelové buňky lidských dýchacích cest v kultuře pro studium molekulárních mechanismů zánětlivé reakce vyvolané částicemi výfukových plynů. Cell Biol Toxicol. 18(5):315-20.

16HBE14o- Reference o znečištění ovzduší

Vliv kouření a vapingu na funkci plic

Ukázalo se, že poškození způsobené kouřením tradičních cigaret a e-cigaret (vaping) zvyšuje případy zánětu a poškození epitelu a narušuje obranné funkce hostitele epitelu dýchacích cest. Kromě toho může cigaretový kouř narušovat funkci bariéry epitelu dýchacích cest a přispívat ke vzniku rakoviny plic. 16HBE14o- buněčné linie byly použity v buněčných modelech ke studiu škodlivých účinků kouření cigaret a vapingu na epiteliální buňky lidských dýchacích cest.

Heijink IH, Brandenburg SM, Postma DS, van Oosterhout AJ. 2012. Cigaretový kouř zhoršuje funkci epiteliální bariéry dýchacích cest a obnovu kontaktu mezi buňkami. Eur Respir J. 39(2):419-28.

Hodge S, Hodge G, Ahern J, Jersmann H, Holmes M, et al. 2007. Kouření mění rozpoznávací a fagocytární schopnost alveolárních makrofágů: důsledky pro chronickou obstrukční plicní nemoc. Am J Respir Cell Mol Biol. (6):748-55.

Gerloff J, Sundar IK, Freter R, Sekera ER2, Friedman AE. 2017. Zánětlivá reakce a dysfunkce bariér různými chemickými látkami pro ochucení e-cigaret identifikovanými plynovou chromatografií s hmotnostní spektrometrií v e-kapalinách a e-výparech na epiteliálních buňkách a fibroblastech lidských plic. Appl In Vitro Toxicol. 3(1):28-40.

16HBE14o- Kouření/Vaping Reference

Související produkty

Litujeme, vyskytla se neočekávaná chyba.

Network error: Failed to fetch