Řešení problémů s buněčnou smrtí v buněčných kulturách
Není snad nic více frustrujícího pro kultivátora buněk než vyjmout misku z inkubátoru a zjistit, že je plná mrtvých buněk. Přijít problému na kloub může být velmi náročné a zdlouhavé, ale s pečlivostí a správným vedením záznamů lze smrt buněk v kultuře diagnostikovat a předejít jí.
Buněčná smrt se vyskytuje především ve dvou formách: pasivní a programovaná. Pasivní buněčná smrt neboli nekróza je proces nezávislý na ATP, který je výsledkem náhlého a silného stresu prostředí, který vede k otoku buněk a nakonec k jejich lýze. Naproti tomu programovaná buněčná smrt je závislá na ATP. Jedna z forem - apoptóza - může být spuštěna zvenčí nebo zevnitř a vede ke zmenšení buňky, zvýšení koncentrace cytosolického Ca2+ a k odkrvení membrány. Další forma programované buněčné smrti -autofagie - je proces, který za normálních okolností podporuje přežití buněk tím, že degraduje a recykluje buněčné složky prostřednictvím lysozomálního systému buňky. Za extrémních stresových podmínek však může autofagie vést k buněčné smrti a je charakterizována přítomností vezikul, která zahrnuje mitochondrie, endoplazmatické retikulum a ribozomy a poté je dopravuje do lyzozomálního systému. Nedávný výzkum naznačuje, že apoptóza a nekróza jsou dva extrémy mezi až deseti nebo více různými formami buněčné smrti a že mezi těmito dvěma procesy existuje značná vzájemná interakce.
Obrázek 1.Dvojité barvení živých a mrtvých buněk.
Tolik možností, jak jít dál: Může být hlavním mechanismem potlačování nádorů.
Apoptóza, vnější: programovaná buněčná smrt vyvolaná extracelulárními signály, které začínají ligací transmembránových receptorů, včetně FAS
Apoptóza, vnitřní: programovaná buněčná smrt, která může, ale nemusí být závislá na kaspáze, charakterizovaná změněným potenciálem mitochondriální membrány
Autofágní buněčná smrt: cytoplazmatická vakuolizace s nerozlišujícím katabolismem cytoplazmatického obsahu
Ferroptóza: Na železe závislá, neapoptotická, oxidativní buněčná smrt, vyvolaná vychytáváním cysteinu
Nekroptóza: programovaná forma nekrózy, charakterizovaná signalizací TNFR1 prostřednictvím RIP1, kdy je inhibována kaspáza-8
Nekróza: předčasná buněčná smrt, často v důsledku infekce nebo poranění
Parthanatos: vyčerpání ATP a NAD+ nadměrnou aktivitou polymerázy
Částečná demolice/kornifikace: trvalá změna struktury a funkce buňky, obvykle závislá na kaspáze. Příklady zahrnují enukleaci erytrocytů, tvorbu vláken čočky a keratinizaci kožních buněk.
Pyroptóza: apoptóza zprostředkovaná kaspázou-1 pozorovaná za zánětlivých podmínek - zodpovědná za úbytek T buněk u HIV/AIDS
Druhotná nekróza: nekróza, která vzniká jako následek apoptózy, často pozorovaná v buněčných kulturách
Přístup k buněčné smrti a její řešení
Pečlivé mikroskopické vyšetření kultivačních nádob může odhalit zjevnou buněčnou smrt charakterizovanou buněčnou kranací, krvácením a zbytky, které se zčásti skládají z buněčných "duchů" nebo membránových zbytků. Pro jemnější případy existuje řada testů dostupných pro posouzení buněčné smrti v kulturách. Snad nejdostupnější z nich je trypanová modř vylučovací test který je založen na principu, že zdravé buňky s neporušenými membránami vyloučí barvivo, a rychle se provádí na oddělených nebo suspenzních buňkách pomocí nbsp;hemacytometrem. K rozlišení a kvantifikaci živých buněk lze použít testy živosti -. Tyto testy hodnotí životaschopnost buněk měřením buněčných funkcí, jako je aktivita enzymů, produkce ATP, funkce plazmatické membrány a adherence buněk.
Obrázek 2.Počítání buněk pomocí hemocitometru a trypanové modři.
| Kořen / příčina | Řešení |
|---|---|
| Po rozmrazení ze zásoby není/je málo životaschopných buněk | |
| Zásobní kultura byla nekvalitní | Ujistěte se, že výchozí kultura použitá k vytvoření zásoby byla řádně identifikována a je zdravá, bez mikrobiální kontaminace a v pozdní logaritmické fázi růstu (ale ne 100% konfluentní). Buňky sklízejte šetrně, aby nedošlo k jejich poškození. |
| Zásoby byly nesprávně skladovány | Zásoby by měly být vždy skladovány při teplotě nižší než -130 °C, ideálně v tekutém dusíku, aby byla zajištěna maximální životaschopnost. Skladování v parní fázi nad kapalným dusíkem je vhodnější než skladování v samotné kapalině kvůli riziku výbuchu lahvičky při rozmrazování, pokud by do lahvičky unikl kapalný dusík. |
| Sklad byl rozmrazen nesprávně | Při rozmrazování buněk postupujte podle protokolu doporučeného dodavatelem. Obecně platí, že buňky by měly být rozmrazovány rychle. Používejte předem ohřátá média. Média obsahující kryoprotektivum odstraňte co nejdříve, abyste zabránili snížení životaschopnosti. Zajistěte, aby se s buňkami zacházelo opatrně. Nevířte ani neodstřeďujte při vysokých rychlostech, protože buňky jsou po kryokonzervaci obzvláště náchylné k poškození. |
| Slabá přilnavost buněk po rozmrazení ze zásoby nebo pasážování | Seznam možných příčin oddělování buněk naleznete zde |
| Úmrtí buněk v dříve zdravé kultuře | |
| Buňky byly pasážovány příliš mnohokrát | Získejte novou zásobu buněk, která byla subkultivována méněkrát. |
| Kolísání teploty v inkubátoru | Ručně zkontrolujte teplotu v inkubátoru nezávislým teploměrem. Protože i několik minut vysoké teploty může vést k odumření buněk, zaznamenávejte teplotu v průběhu času. |
| CO2 je kontaminován cytotoxickými složkami | Používejte CO2 vhodný pro buněčné kultury. |
| Hladiny CO2 neodpovídají tomu, co potřebuje pufrovací systém na bázi hydrogenuhličitanů v použitém médiu, což vede k nedostatečné kontrole pH | Ujistěte se, že hladiny CO2 v inkubátoru odpovídají hodnotám, které vyžaduje pufrovací systém. Obecně platí, že čím vyšší je hladina hydrogenuhličitanu v pufru, tím vyšší je koncentrace CO2 potřebná. |
| Mikrobiální kontaminace | Viz Kontaminace buněk kde naleznete rozsáhlý seznam způsobů, jak mikrobiální kontaminaci předcházet a jak ji eliminovat. Všimněte si, že zatímco na vině mohou být plísně, viry a mnoho typů bakterií, kontaminace mykoplasmou způsobuje smrt buněk jen zřídka. |
| Vystavení kultur fluorescenčnímu světlu způsobuje, že složky média citlivé na světlo (riboflavin, tryptofan a HEPES) se přeměňují na cytotoxické volné radikály a H<2O2 | Uskladněte buňky a média ve tmě mimo dosah fluorescenčního světla. |
| Buňky se staly příliš srostlými | K odumírání buněk dochází při přeplnění kultur. Buňky propouštějte až v pozdní logaritmické fázi růstu; nedovolte, aby konfluence překročila 80 %. |
| Média, séra, pufry atd. jsou nekvalitní nebo nesprávně složené. | Stávající činidla vyhoďte a použijte nové šarže. Pokud po použití nových činidel dojde k odumření buněk, identifikujte případné podezřelé šarže. Před zavedením do cenných nebo nenahraditelných kultur otestujte všechny nové šarže činidel v kultuře. |
Odkazy
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?Toto je strojově přeložená stránka.
