L-Tyrosin v buněčných kulturách
Co je to L-tyrosin?
L-tyrosin je jednou z dvaceti aminokyselin používaných při biosyntéze bílkovin. Poprvé byla objevena v roce 1846, kdy ji německý chemik Justus von Liebig extrahoval z kaseinu, bílkoviny obsažené v mléce a sýrech. Aminokyselina byla pojmenována podle řeckého slova "tyros", což znamená sýr. Díky svému postrannímu řetězci patří L-tyrosin také do skupiny aromatických, polárních a hydrofobních aminokyselin.
Obrázek 1.Struktura L-tyrosinu
L-tyrosin je považován za neesenciální aminokyselinu, protože si ho tělo může samo vyrobit. U savců se L-tyrosin přeměňuje z L-fenylalaninu, esenciální aminokyseliny. Fenylalanin se získává z potravy pomocí enzymu fenylalaninhydroxylázy (EC 1.14.16.1).
Obrázek 2.Biosyntéza L-tyrosinu u savců
L-tyrosin je všeobecně uznáván jako důležitá aminokyselina pro růst a životaschopnost buněk. L-tyrosin je součástí proteinů a dalších biologicky důležitých molekul, jako jsou neurotransmitery, hormony, pigment melanin a koenzym Q10.
Funkce L-tyrosinu
L-tyrosin pomáhá utvářet 3D strukturu bílkovin prostřednictvím interakcí s dalšími aminokyselinovými zbytky v bílkovině. Fenolový kruh tyrosinu je částečně hydrofobní a polární, což L-tyrosinu propůjčuje jak hydrofobní, tak hydrofilní vlastnosti.
Tyto fyzikálně-chemické vlastnosti činí z L-tyrosinu nejúčinnější zbytek pro zprostředkování molekulárního rozpoznávání. Tyrosinové zbytky mohou být umístěny na povrchu bílkovin, na vazebných rozhraních nebo pohřbeny uvnitř bílkoviny. Často je obohacen na povrchu proteinů, které vážou malé molekuly, nukleové kyseliny nebo proteinové partnery, a hraje rozhodující roli v interakci proteinu s jeho partnery1,2.
Modifikace L-tyrosinu může dramaticky změnit strukturu proteinu. Tyrosin může být fosforylován, čímž se přemění na fosfotyrosin. Tato fosforylace je klíčovým krokem při přenosu buněčné signalizace, diferenciaci buněčné migrace, buněčném cyklu, genové regulaci a nervovém přenosu.
Tyrosin lze také sulfátovat, a to v procesu známém jako tyrosinsulfatace. Tato modifikace je nezbytná pro několik biologických procesů, včetně proteolytické aktivace koagulačních faktorů V a VIII trombinem a proteolýzy řetězce C4a komplementu pomocí C1s. Sulfatace tyrozinu ko-receptoru HIV-1 CCR5 je také nutná pro vstup viru do hostitelských buněk.
Oba fosforylace a sulfatační modifikace lze detekovat pomocí protilátek.
Obrázek 3.Struktura fosfotyrosinu
Obrázek 4.Struktura sulfotyrosinu
L-tyrosin hraje v těle kromě role proteinogenní aminokyseliny několik důležitých rolí. Působí jako prekurzor pro biosyntézu několika neurotransmiterů včetně dopaminu, noradrenalinu a adrenalinu3. Je také výchozím substrátem melanogeneze4 a biosyntézy koenzymu Q105. Ve štítné žláze se z L-tyrosinu z tyreoglobulinu syntetizuje tyroxin, důležitý hormon pro regulaci metabolismu, a to postupnou jodací fenolových kruhů tyrosinu6. Tyrosinové zbytky v membránových bílkovinách mohou také pomáhat chránit integritu membrán buněk před oxidačním stresem7.
L-tyrosin v buněčných kulturách
L-tyrosin jako neesenciální aminokyselina může být produkován buňkami. Neesenciální aminokyseliny však mohou být přesto přidávány do média buněčných kultur, aby se zvýšil růst a životaschopnost kultur. Když se do média přidají neesenciální aminokyseliny, mohou si buňky uchovat více energie, získat výživu a vyhnout se toxickým vedlejším produktům vznikajícím při biosyntéze. L-tyrosin je jednou ze složek aminokyselin v mnoha médiích pro buněčné kultury včetně MEM., DMEM a RPMI. U některých buněčných linií je ještě nutné doplňovat L-tyrosin.
Doplňování L-tyrosinu je důležité při výrobě monoklonálních protilátek (mAb) pomocí buněčných kultur vaječníků čínského křečka (CHO)8. Nedostatečný přísun L-tyrosinu snižuje specifickou produktivitu a může způsobit tyrosinové sekvenční varianty - tyrosinové zbytky nahrazené buď fenylalaninem, nebo histidinem. U všech velkých výrob monoklonálních protilátek je nutné optimalizovat koncentraci L-tyrosinu spolu s dalšími aminokyselinami.
Reaktivní formy kyslíku (ROS) jsou přirozenými vedlejšími produkty aerobního metabolismu. ROS jsou vysoce reaktivní vůči bílkovinám, lipidům, RNA a DNA a při jejich příliš vysoké hladině ovlivňují zdraví buněk9. L-tyrosin může zesílit produkci ROS závislou na riboflavinu10. Suplementace L-tyrosinem by měla být dobře optimalizována při kultivaci buněk citlivých na oxidační stres, jako jsou kmenové buňky a některé nádorové buněčné linie.
Agarové desky s přídavkem tyrosinu se používají také ke kultivaci bakterií, včetně některých druhů Bacillus, Nocardia a Streptomyces.
L-tyrosin vlastnosti v médiích pro buněčné kultury
L-tyrosin má velmi nízkou rozpustnost (0,45 mg/ml) ve vodě při neurálním pH. Pro přípravu zásobního roztoku se L-tyrosin rozpouští při extrémním pH, a to buď při pH nižším než 2, nebo vyšším než pH 9. Lze jej také rozpustit v organickém rozpouštědle, jako je DMSO s vyšší rozpustností11.
Dihydrát disodné soli L-tyrosinu má ve srovnání s L-tyrosinem mnohem lepší rozpustnost (100mg/ml). Aby se zabránilo vnášení pH šoku, nežádoucího rozpouštědla nebo vysokého obsahu soli do média, jsou dipeptidy, které obsahují L-tyrosin, jako například glycyl-L-tyrosin, spolehlivou náhradou v případě potřeby vysokých koncentrací L-tyrosinu.
Chemické charakteristiky L-tyrosinu
L-tyrosin má molekulární vzorec C9H11NO3 a molekulovou hmotnost 181. Jeho molekulová hmotnost je 1,5 %.191 g/mol. Má izoelektrický bod 5,63 a pKa 2,2 a 9,21.
Tyrosin je relativně stabilní aminokyselina. Tyrosin však podléhá halogenaci, pokud je v roztoku přítomna vysoká koncentrace HCl. Při použití L-tyrosinu v buněčných kulturách nebo jiných biologických aplikacích je důležité používat čerstvý a správně skladovaný tyrosin, aby byla zajištěna maximální účinnost a efektivita.
Odkazy
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?