Biotin v buněčných kulturách

Význam a použití biotinu v bezsérových eukaryotických kulturách, včetně hybridomových a buněčných kultur vaječníků čínského křečka (CHO)

Biotin, jak klasická média tak doplněk bezsérových médií, využitelný v biotechnologiích, tkáňovém inženýrství a speciálních médiích:

Biotin je důležitý vitamín rozpustný ve vodě, který se nachází v mnoha médiích. Mezi ně mohou patřit bezsérová média používaná pro biomanufacturing, tkáňové inženýrství, výrobu vakcín a další komerčně užitečné aplikace.

Biotin se nachází v mnoha klasických médiích včetně: Amesovo médium; základní médium Eagle (BME); médium BGJb Fitton-Jacksonova modifikace; médium CMRL-1066; DMEM/Hamova směs živin F-12 (50:50); EMEM-alfa; Coonova modifikace F-12; Fischerovo médium; H-Y médium (Hybri-Max^®); Iscoveho modifikované Dulbeccovo médium (IMDM); McCoyovo modifikované médium 5A; MCDB Medium; Medium 199; NCTC Medium; Nutrient Mixtures, Ham's F-10; Nutrient Mixtures, Ham's F-12; Nutrient Mixture Ham's F-12 Kaighn's Modification (F12K); RPMI-1640; Serum-Free/Protein Free Hybridoma Medium; Waymouth Medium MB; Williams Medium E a různá speciální média.

Je třeba poznamenat, že kultivační média která postrádají biotin, jsou obecně založena na Minimum Essential Medium Eagle (EMEM) a zahrnují: Clickovo médium; Dulbeccovo modifikované orlí médium (DMEM); Glascowovo minimální esenciální médium (GMEM); a Swimovo médium S-77. IMDM a EMEM-alfa jsou výjimky obsahující biotin. Médium L-12 rovněž neobsahuje biotin.

Základní klasická média používaná při vývoji bezsérových přípravků pro biomanufacturing heterologních proteinů a další komerční aplikace obvykle obsahují biotin buď jako součást základního přípravku, nebo jako nový přídavek do patentovaného nebo speciálního média.

Doplňování médií biotinem pro bezsérové kultivace eukaryotických buněk je komplikováno skutečností, že biotin je náchylný k oxidačnímu stresu a inaktivaci u.v. zářením. Proto účinné použití biotinu v kultivačních médiích pro buňky vyžaduje pochopení jeho chemického složení. Úplnější informace o biotinu jako o doplňku pro buněčné kultury doplňku pro média naleznete na stránkách Media Expert.

Primární funkce biotinu v médiích pro buněčné kultury:

Biotin je esenciální vitamin, který je důležitý pro metabolismus aminokyselin a energie a syntézu mastných kyselin. Je prostetickou skupinou ve čtyřech rodinách karboxyláz savců a usnadňuje vazbu a přenos oxidu uhličitého. Enzymy obsahující biotin jsou pyruvátkarboxyláza (EC 6.4.1.1), acetyl-CoA karboxyláza (EC 6.4.1.2), methylkrotonyl-CoA karboxyláza (EC 6.4.1.4) a proprionyl-CoA karboxyláza (EC 6.4.1.3). Všechny tyto čtyři enzymy jsou poháněny ATP. Pyruvátkarboxyláza a acetyl-CoA karboxyláza jsou důležité pro syntézu mastných kyselin. Methylkrotonyl-CoA karboxyláza a proprionyl-CoA karboxyláza se podílejí na odbourávání leucinu a methioninu, respektive isoleucinu a homocysteinu.

Význam in vitro:

Při absenci biotinu nemohou savčí buňky syntetizovat mastné kyseliny. Proto jsou tyto buňky závislé na vnějších zdrojích mastných kyselin, včetně skupiny palmitoylových mastných kyselin. Nemohou přeměňovat methionin, isoleucin, homocystein nebo leucin na meziprodukty TCA cyklu a nemohou přeměňovat přebytečný pyruvát na mastné kyseliny.

Biotinový proteinový cyklus:

Karboxylázy jsou syntetizovány jako apokarboxylázy. Biotin je do karboxyláz přidáván biotinovými holokarboxylázovými syntetázami, jako je biotinová holokarboxylázová syntetáza (EC 6.3.4.10). Tyto synthetasy připojují biotin k epsilonové aminoskupině lysinu a vytvářejí epsilon-N-biotinyl-L-lysyl zbytek aminokyseliny. Při rozkladu karboxylázových proteinů se uvolňuje tato aminokyselina, která je také známá jako biocytin. Biotin může být z biocytinu uvolněn všudypřítomným enzymem savčích buněk zvaným biotinidasa (EC 3.5.1.12). Biotinidasy mohou mít další role zahrnující transport a využití biotinu v buňce.

Biotinylace proteinů a polyaminů:

Biotin může hrát roli v regulaci transkripce a opravě DNA. Zdá se, že enzym biotinidáza za určitých podmínek funguje jako biotin-transferáza a přenáší biotin na lysylové zbytky histonů a polyaminů. Histony jsou důležité proteiny, které ovlivňují strukturu chromatinu a přístup regulačních a opravných proteinů k DNA. Biotinylace histonů může hrát roli při umlčování genů a buněčné odpovědi na poškození DNA. Polyaminy se podílejí na důležitých mitochondriálních funkcích.

Biotin a histony mimo jádro mají některé aktivity podobné inzulinu. Zvyšují příjem glukózy a stimulují syntézu cGMP a tvorbu oxidu dusnatého. Biotin může indukovat glukokinázu.

Chemické vlastnosti biotinu, které z něj činí užitečný bezsérový doplněk stravy

Biotin:

Vitamin H, koenzym R

Biotin má ve svém kruhu atom síry jako thiamin a příčnou vazbu napříč kruhem. Biotin má tři asymetrické uhlíky a může existovat jako osm různých izomerů. Biologicky aktivní je pouze izomer d-(+)-biotin, D-Biotin.

Složení: D-biotin je biologicky aktivní: C₁₀H₁₆N₂O₃S

Molekulová hmotnost: 244,31

Isoelektrické pH = 3.5

Biotin je:

• rozpustný ve vodě;
• rozpustný ve zředěných zásadách a horké vodě;
• relativně stabilní v kyselém a neutrálním rozmezí pH

Biocytin:

Volně rozpustný ve vodě

Prekurzorová forma biotinu, přeměněná na biotin biotinázou.

Stabilita biotinu:

Biotin je za fyziologických podmínek relativně stabilní vitamin, ale může být citlivý na prvky oxidačního stresu. Peroxidované nenasycené mastné kyseliny nebo vystavení ultrafialovému záření mohou biotin inaktivovat. Částečná ochrana vitaminem E naznačuje, že k této inaktivaci pravděpodobně dochází útokem volných radikálů na biotin zprostředkovaným mastnými kyselinami. Nejcitlivějším místem je pravděpodobně atom síry. Oxidačními produkty biotinu jsou biotin sulfoxid a biotin sulfon. Dalšími látkami, které mohou biotin inaktivovat, jsou formaldehyd, kyselina dusičná a cholin.

Produkty biotinu, které zvyšují růst hybridomových buněk, vaječníků čínského křečka (CHO) a dalších savčích eukaryotických buněk v kulturách bez séra: