Antibiotická křivka zabíjení

• Co je to křivka zabíjení antibiotik?
• Doporučené koncentrace antibiotik pro křivku zabíjení
• Protokol pro Kill Curve
• Body k zapamatování

Co je to křivka zabíjení antibiotikem?

Křivka zabíjení antibiotikem je experiment s odezvou na dávku, při kterém jsou savčí buňky vystaveny rostoucímu množství vybraného antibiotika, aby se určila minimální koncentrace antibiotika, která může zabít všechny buňky za určitou dobu. Jedná se o klíčový krok před použitím selekčního antibiotika k usmrcení netransfekovaných buněk a vytvoření stabilních buněčných linií. Vzhledem k tomu, že se jednotlivé buněčné linie savců liší v citlivosti na antibiotika, doporučuje se vždy provést samostatné experimenty s křivkami usmrcení pro různé buněčné linie a antibiotika.

Doporučené koncentrace antibiotik pro křivku usmrcení

Níže uvedená tabulka uvádí rozsahy koncentrací běžně používaných selekčních antibiotik, které lze použít při experimentech s odezvou na dávku.

Odezva na dávku se může lišit v závislosti na testované buněčné linii. Koncentrační rozsahy jsou pouze orientační; při prvním použití nebo použití na nové buněčné linii je třeba provést křivku usmrcení s každým selekčním antibiotikem.

Tabulka 1 Doporučené koncentrace výběrových antibiotik

Výběr antibiotik	Číslo výrobku	Konc. Rozsah
Actinomycin D	A9415	5 - 10 µg/ml
Bleomycin sulfát	B8416	10 - 50 µg/ml
Karbenicilin	C3416	100 - 1000 µg/ml
Chloramfenikol	C3175 C1919	5 - 50 µg/ml
Disulfátová sůl G 418	A1720 G1279	100 - 800 µg/ml
roztok disulfátové soli G 418	G8168	100 - 800 µg/ml
Gentamicin sulfát	G1264	50 - 1000 µg/mL
Gentamicin roztok	G1272 G1397 G1522	50 - 1000 µg/ml
Hygromycin B	H3274 H9773	200 - 800 µg/ml
Kanamycin sulfát	K1377	100 - 1000 µg/ml
Roztok kanamycinu	K0254 K0129	100 - 1000 µg/ml
Mitomycin C	M4287 M4287 M7949 M5353	10 - 100 µg/ml
Kyselina mykofenolová	M3536	25 µg/ml
Neomycin trisulfát	N6386 N3144	10 - 100 µg/ml
Roztok neomycinu	N1142	10 - 100 µg/ml
Nourseothricin sulfát	N0186	75 - 100 µg/ml
Paromomycin sulfát	P8692 P5057	100 - 1000 µg/ml
P5057Puromycin	P8833	10 - 100 µg/ml
Roztok puromycinu	P9620	10 - 100 µg/ml
Rifampicin	R7382	10 - 50 µg/ml

Protokol pro křivku usmrcení

Následující protokol popisuje kroky pro vytvoření křivky usmrcení pro vaše buňky.

Co budete potřebovat: Připravte se na akci, která se bude konat ve dnech 1. až 3. května, kdy se bude konat v noci:

• Buněčnou linii vašeho zájmu ve zdravém stavu
• Kompletní kultivační médium (médium .nbsp;+ sérum) doporučené pro vaši buněčnou linii
• Výběrové antibiotikum podle vašeho zájmu

Kroky: 1. Vložte do média (média), které je doporučeno pro vaši buněčnou linii

Vyberte si antibiotikum podle vašeho zájmu

Kroky:

• Získejte zdravé adherentní buňky buď pomocí trypsinu nebo jemným seškrábnutím buněk.
• Zřeďte buněčnou suspenzi v kompletním médiu a osejte každou jamku 96jamkové destičky tak, aby konečný objem byl 100 ul. Doporučená hustota buněk je ~50 % v den léčby.
• Typická hustota buněk před léčbou antibiotiky na 24jamkové destičce:
• 0,8 - 2,5 X 10⁵ buněk/ml adherentních buněk
• 2,5 - 4.5 X 10⁵ buněk/ml suspenzních buněk
• Inkubujte při 37 ^oC přes noc nebo dokud nejsou všechny buňky dobře přizpůsobené a zdravé.

Poznámka: Antibiotika jsou nejúčinnější, když jsou buňky v aktivním dělení; pro co nejpřesnější dávkovou odezvu se proto doporučuje optimální hustota buněk.

Obrázek 1. Schematický průvodce - výběr koncentrace antibiotik.

• Vyměňte médium za čerstvé médium obsahující různé koncentrace selekčního antibiotika. Každou koncentraci uchovávejte ve třech opakováních, jak je uvedeno ve formátu 96jamkové destičky (obrázek 1).
• Vyměňte médium s antibiotikem každých 48 hodin.
• Kultivujte buňky po dobu 7 - 10 dnů a pravidelně je pozorujte pod světelným mikroskopem. Délku kultivace lze prodloužit až na 14 dní v závislosti na použité buněčné linii.
• Den 10 stanovte životaschopnost buněk v každé jamce buď pomocí MTT testu, nebo přesným počítadlem buněk.
• Zvolte takovou koncentraci antibiotika, která zcela zablokuje růst buněk. Tuto koncentraci použijte při všech transfekčních experimentech, abyste vybrali rezistentní, transfekované buňky, které lze dále pěstovat jako stabilní buněčné linie (obrázek 2).

Obrázek 2. Zkušební křivka zabíjení antibiotik

Body k zapamatování

• Udržujte vhodné kontrolní prvky nebo prázdná místa:
  • jímky obsahující pouze médium s antibiotikem, bez buněk
  • jímky obsahující médium a buňky, bez antibiotika
• Ujistěte se, že inkubátor je v perfektním provozním stavu, aby se zabránilo odpařování média, které by mohlo zvýšit koncentraci antibiotika a vést k falešným údajům
• Vyhledejte, zda je inkubátor v perfektním stavu./li>

Vyberte správná antibiotika pro vaše buňky.

Prozkoumejte celé naše portfolio antibiotik pro vaše výzkumné použití.

Klikněte pro prozkoumání celé naší nabídky buněčných kultur pro vaše výzkumné využití.