Subkultury adherentních buněčných linií

Adherentní buněčné linie budou růst in vitro až do té doby, než pokryjí dostupnou plochu nebo dokud nebude médium vyčerpáno živinami. V tomto okamžiku by měly být buněčné linie subkultivovány nebo pasážovány, aby se zabránilo odumření kultury. Aby bylo možné buňky subkultivovat, je třeba je uvést do suspenze. Stupeň adheze se u jednotlivých buněčných linií liší, ale ve většině případů se používají proteázy, např. trypsin, se používají k uvolnění buněk z baňky. Tento postup však nemusí být vhodný pro některé linie, kde je vystavení proteázám škodlivé nebo kde použité enzymy odstraňují membránové markery/receptory, které jsou předmětem zájmu. V těchto případech by měly být buňky uvedeny do suspenze v malém objemu média mechanicky pomocí buněčných škrabek.

Přečtěte si více informací

• Přehled subkultivačních protokolů
• Materiály
• Vybavení
• Postup při subkulturách
• Klíčové body
• Související produkty

Přehled subkulturního protokolu

Hodnocení kultur

Odstranění použitého média

Promývání buněk pomocí PBS bez CA²⁺/Mg²⁺

V případě potřeby opakujte

Pipetujte trypsin/EDTA na buněčnou monovrstvu

• Otočná baňka
• Dekantace přebytků

Inkubujte 2-10 minut

Zkoumání buněk

Opětovná suspenze buněk v čerstvém médiu

Přenos buněk do čerstvého, zahřátého, nového média

Inkubujte podle potřeby

Opakujte podle potřeby

Materiály

• Média pro buněčné kultury: Předehřáté na vhodnou teplotu (správné médium a teplotu naleznete v datovém listu buněčné linie ECACC.)
• 70% (v/v) alkohol ve sterilní vodě (793213)
• PBS bez Ca²⁺/Mg²⁺ (D8537)
• 0.05% trypsin/EDTA v HBSS, bez Ca²⁺/Mg²⁺  (T3924)
• Inhibitor sójového trypsinu (T6522) nebo FBS
• Roztok krypanové modři (T8154)

Vybavení

• Osobní ochranné prostředky (sterilní rukavice, laboratorní plášť, ochranný štít)
  • Osobní ochranné pomůcky (sterilní rukavice, laboratorní plášť, ochranný štít)
  • Vodní lázeň nastavená na vhodnou teplotu
  • Mikrobiologická bezpečnostní skříň s vhodnou úrovní izolace
  • Inkubátor
  • Předem označené baňky
  • Invertovaný mikroskop s fázovým kontrastem
  • Centrifuga
  • Hemocytometr nebo automatické počítadlo buněk, jako je Počítač buněk Scepter™
  • Značkové pero
  • Pipety
  • Stojan na ampule
  • Tkáň

  Postup při subkulturaci

1. Prohlédněte kultury pomocí inverzního mikroskopu, abyste posoudili stupeň konfluence a potvrdili nepřítomnost bakteriálních a plísňových kontaminantů.
2. Odstraňte spotřebované médium.
3. Omyjte buněčnou monovrstvu pomocí PBS bez Ca²⁺/Mg²⁺. Tento promývací krok opakujte, pokud je známo, že buňky silně adherují.
4. Pipetujte trypsin/EDTA na promytou buněčnou monovrstvu s použitím přibližně 1 ml na 25 cm² povrchu. Otáčejte baňkou, aby se monovrstva pokryla trypsinem. Přebytečný trypsin dekantujte.
5. Vraťte baňku do inkubátoru a nechte ji 2-10 minut působit.
6. Prohlédněte buňky pomocí obráceného mikroskopu, abyste se ujistili, že jsou všechny buňky oddělené a plovoucí. Na stěnu baňky lze jemně poklepat, aby se uvolnily zbývající přichycené buňky.
7. Buňky znovu rozpusťte v malém objemu čerstvého média obsahujícího sérum, aby se inaktivoval trypsin. Odeberte 100-200 μl a proveďte počet buněk. V případě buněk kultivovaných v médiu bez séra použijte k inaktivaci trypsinu inhibitor trypsinu, například sójový inhibitor trypsinu.
8. Přeneste požadovaný počet buněk do nové označené baňky obsahující předehřáté médium (požadovanou hustotu výsevu najdete v příslušném datovém listu buněčné linie ECACC).
9. Inkubujte podle potřeby buněčné linie.
10. Tento postup opakujte podle růstových vlastností buněčné linie.

Klíčové body

1. Některé kultury, i když rostou jako připojené linie, přilnou k baňce jen lehce, proto je důležité zajistit, aby kultivační médium zůstalo zachováno, a s baňkami se zachází opatrně, aby nedošlo k předčasnému oddělení buněk.
2. Ačkoli se většina buněk oddělí v přítomnosti samotného trypsinu, EDTA zvyšuje aktivitu enzymu odstraněním inhibičních kationtů.
3. Trypsin se inaktivuje v přítomnosti séra. Proto je nezbytné odstranit všechny stopy séra z kultivačního média promytím monovrstvy buněk PBS bez Ca²⁺/Mg²⁺.
4. Buňky by měly být vystaveny trypsinu/EDTA pouze tak dlouho, aby došlo k jejich oddělení. Delší expozice by mohla poškodit povrchové receptory buněk.
5. Trypsin by měl být neutralizován sérem před nasazením buněk do nových baněk, jinak se buňky nepřichytí.
6. Trypsin může být také neutralizován přidáním inhibitoru sójového trypsinu, kdy se k trypsinizovaným buňkám přidá stejný objem inhibitoru o koncentraci 1mg/ml. Buňky se poté odstředí, resuspendují v čerstvém kultivačním médiu a spočítají se výše uvedeným způsobem. To je nutné zejména u buněčných kultur bez séra.
7. Pokud není k dispozici CO₂ inkubátor, baňky se na 1-2 minuty zplyní 5% CO₂ v 95% vzduchu filtrovaném přes 0,2 μm filtr.
8. Pokud mají sklizené buňky příliš nízkou buněčnou hustotu, než aby je bylo možné znovu nasadit s odpovídající buněčnou hustotou do čerstvých baněk, může být nutné buňky odstředit, např. 5 minut při 150 x g, a znovu je suspendovat v menším objemu média.

Obrázek 1. Příklady adherentní buněčné linie. Buňky NIH 3T3 24 hodin (A) a 72 hodin (B) po zmrazení/rozmrazení vykazují typickou adherentní fibroblastickou morfologii. Konfluence by měla být pečlivě sledována a pasážována, když buňky dosáhnou ~80% konfluence.