Protokol disociace buněk s trypsinem
Trypsin v buněčných kulturách
Disociace buněk je proces při pasážování buněk, kdy se buňky oddělují od ošetřeného povrchu a vytvářejí suspenze. Tyto suspenze jsou důležité pro opětovné nasazení pro subkultury, počítání buněk pro analýzu a množení buněk. K oddělení buněk od přilnavého substrátu se používají různé proteolytické enzymy, včetně trypsinu.
Trypsin je členem rodiny serinových proteáz, které se často používají k oddělení buněk. Optimální aktivita trypsinu nastává při teplotě 37 °C, proto se k urychlení oddělování buněk často používá předem zahřátý trypsin. Dlouhodobá inkubace s vysokými koncentracemi trypsinu však může poškodit buňky tím, že z nich odstraní povrchové proteiny a buňky usmrtí.
Vlastnosti trypsinu
Trypsin je tolerován mnoha typy buněk. Proteomické studie a experimenty vyžadující bezsérové kultury se však použití trypsinu často vyhýbají. Na základě aplikace a typu buněk lze použít různé složky a koncentrace trypsinu. Některé z těchto atributů jsou popsány níže.
- EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová disodná): Adhezní molekuly v přítomnosti vápníku určují interakce mezi buňkami a matricí. EDTA je často součástí trypsinu, aby se chelátovala s dvojmocnými kationty (Ca2+, Mg 2+) a oslabila tyto interakce.
- Fenolová červeň: Trypsin má optimální aktivitu v rozmezí pH 7 až 9. V případě, že je trypsin v rozmezí pH 7 až 9, je jeho aktivita nižší než u jiných látek. V tomto rozmezí dává inkluze fenolové červeně roztoku růžovou barvu. Vlivem podmínek prostředí se pH trypsinu může změnit na kyselé, čímž se jeho účinnost sníží a vznikne oranžové zbarvení. Úpravou pH na 7,4 - 7,6 pomocí NaOH lze aktivitu trypsinu obnovit.
- Ředidlo: K udržení pH a osmotické rovnováhy lze koncentrovaný trypsin ředit nebo rozpouštět pufrovaným roztokem soli, který neobsahuje Ca2+ ani Mg2+, jako je Hank's Balanced Salt Solution . Některé trypsinové přípravky lze také ředit v 0,9% NaCl.
- Zdroj a forma: NaCl: Hlavním zdrojem trypsinu je prasečí (vepřový) a je k dispozici buď v lyofilizovaném prášku, nebo jako roztok. Aby se předešlo živočišným nebo mikrobiálním produktům, je rekombinantní hovězí trypsin, Trypzean solution, vyjádřen v kukuřici.
- Koncentrace: Podle typu buněk a aplikace se trypsin používá v různých koncentracích. U silně adherentních buněčných linií se používá trypsin o koncentraci 2,5 % až 0,25 % (síla 10x až 1x). Nižší koncentrace trypsinu, například 0,05 %, lze použít pro studie, které vyžadují zachování integrity povrchových proteinů buněk.
Protokol trypsinizace
Tento protokol se provádí při zachování aseptického prostředí, například v laminárním biologicky monitorovaném odsavači.
- Předehřejte roztok trypsinu, vyvážený roztok soli (roztok bez Ca+2 a Mg+2) a růstové médium na teplotu 37 °C
- Prohlédněte buňky, abyste se ujistili, že jsou zdravé a bez kontaminace
- Vyšetřete buňky, abyste se ujistili, že jsou zdravé a bez kontaminace.br>
- Odstraňte a vyhoďte kultivační médium z baňky
- Odstraňte roztok a jemně propláchněte buňky vyváženým roztokem soli bez Ca+2 a Mg+2 iontů. Pevně adherující buňky lze také propláchnout roztokem tryspinu. U citlivých buněk se však dává přednost vyváženému solnému roztoku.
- Přidejte na boční stěnu baňky odpovídající množství (0,5 ml/10 cm2) předehřátého roztoku trypsinu. Jemně obsah promíchejte, aby se pokryla vrstva buněk.
- Inkubujte nádobu při pokojové teplotě po dobu 2-3 minut (doba inkubace se liší podle použité buněčné linie). Pevně adherující buňky lze při teplotě 37 °C rychle oddělit. Pozorujte buňky pod mikroskopem. Oddělené buňky se pod mikroskopem jeví jako zaoblené a lámavé. Pokud je odděleno méně než 90 % buněk, inkubujte baňku další 2 minuty a každých 30 sekund pozorujte buňky pod mikroskopem.
Poznámka: Zabraňte vystavení buněk roztoku trypsinu po delší dobu (>=10 min)
- Jakmile se buňky objeví oddělené, přidejte dva objemy předehřátého kompletního růstového média k inaktivaci trypsinu. Jemně rozptýlíme médium několikerým pipetováním po povrchu buněčné vrstvy, abychom zajistili obnovení >95 % buněk. Pro kultury bez séra, se přidá inhibitor sójového trypsinu v ekvimolární koncentraci k inhibici trypsinu.
Poznámka: Silné pipetování může způsobit poškození buněk.
- Přeneste buněčnou suspenzi do zkumavky a jemně odstřeďujte při 100-300 g po dobu 5-10 min. Po odstranění supernatantu jemně resuspendujte buněčnou peletu v předehřátém kompletním růstovém médiu. Odeberte požadovaný vzorek pro stanovení hustoty životaschopných buněk pomocí hemocytometru a trypanové modři vyloučení nebo automatizovaného počítadla buněk.
- Ze zbývajícího roztoku zřeďte roztok na hustotu výsevu a napipetujte příslušný objem do kultivační baňky a umístěte ji do inkubátoru.
Odkazy
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?