Wykorzystanie unieśmiertelnionych ludzkich linii komórkowych nabłonka oskrzeli 16HBE14o do modelowania chorób płuc układu oddechowego

• Czym są komórki 16HBE14o-?
• Kolekcja linii komórkowych nabłonka ludzkiego płuca
• Kultury komórkowe 3D interfejsu powietrze-ciecz (ALI)<./li>
• Wskazówki i porady dotyczące wykonywania 16HBE14o- ALI przy użyciu wkładów do hodowli komórek stojących Millicell^®
• .Komórkowy model mukowiscydozy i funkcji CFTR
• Mechanizmy wirusowych chorób układu oddechowego (H1N1, SARS-CoV, COVID-19)
• Badania nad astmą i POChP
• Ekspozycja na zanieczyszczenie powietrza
• Wpływ palenia i wapowania na funkcjonowanie płuc

Rysunek 1. Linia komórkowa 16HBE14o- jest odpowiednim modelem do badania mechanizmów molekularnych, który zachowuje charakterystyczne cechy normalnych zróżnicowanych komórek nabłonka oskrzeli.

Czym są komórki 16HBE14o?

Komórki nabłonka oskrzeli tworzą funkcjonalną barierę wzdłuż głównych dróg oddechowych, stanowiąc krytyczną linię obrony przed patogenami układu oddechowego. Modele fizjologiczne są niezbędne do zrozumienia interakcji między chorobami układu oddechowego a komórkami nabłonka. Pierwotne komórki i linie komórkowe hodowane na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) ściśle reprezentują natywne komórki, zachowując kluczowe cechy nabłonka dróg oddechowych in vivo, na które ukierunkowane są wirusy.

Linia komórek nabłonka oskrzeli 16HBE14o (SCC150) została wyizolowana z oskrzeli pacjenta z płucami serca i unieśmiertelniona za pomocą pSVori-, plazmidu SV40 z defektem pochodzenia replikacji. Ta linia komórkowa jest odpowiednim modelem do badania mechanizmów molekularnych i wykazuje wysoki poziom ekspresji mRNA i białka CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). 16HBE14o- zachowuje cechy normalnych zróżnicowanych komórek nabłonka oskrzeli, w tym:

• Morfologia kostki brukowej
• Ekspresja cytokeratyny
• Zdolność do tworzenia ścisłych połączeń (TJ)
• Kierunek transportu
• Kierunkowy transport jonów
• Zdolność do generowania przezbłonowego oporu elektrycznego (TEER)
• Funkcjonalne rzęski wykrywalne podczas hodowli w ALI

Kolekcja ludzkich linii komórkowych nabłonka płuc

Oferujemy kompletną kolekcję ludzkich linii komórkowych nabłonka płuc licencjonowanych przez Gruenert Lab i znajdujących się w NIH Cystic Fibrosis Research Center na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco. Te szeroko opublikowane ludzkie linie komórkowe są cennymi modelami chorób płuc, takich jak mukowiscydoza, astma, przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP) i rak płuc. Zapewniają one również odpowiednie modele in vitro do badania skutków narażenia na zanieczyszczenie powietrza, palenia tytoniu i waporyzacji oraz modelowania infekcji wirusowych układu oddechowego, takich jak grypa H1N1, SARS-CoV, MERS-CoV i COVID-19.

Nazwa linii komórkowej	Tkanka pochodzenia	Genotyp CFTR	Publikacje
16HBE14o- (SCC150)	Bronchi	Wt/Wt	Referencje
1HAEo- (SCC152)	Trachea/Bronchi	Wt/Wt	Referencje
9HTEo- (SCC153)	Trachea	Wt/Wt	Referencje
56FHTE8o- (SCC154)	Trachea	Wt/Wt	Referencje
6CFSMEo- (SCC157)	Gruczoł podśluzówkowy	dF508/Q2X	Referencje
CFSMEo- (SCC155)	Gruczoł podśluzówkowy	dF508/Q2X	Referencje
CFTE29o- (SCC162)	Trachea	dF508/dF508	Referencje
CFBE41o- (SCC151)	Bronchi	dF508/dF508	Referencje
CFBE41o-/CFTR 4.7N (SCC158)	Bronchi	dF508/dF508 transfected Wt	Referencje
CFBE41o-/CFTR DeltaF4.7 (SCC159)	Bronchi	dF508/dF508 transfected dF508	Referencje

Kultury komórkowe 3D z interfejsem powietrze-ciecz (ALI)

Techniki hodowli komórkowej 3D z interfejsem powietrze-ciecz (ALI) wspierają różnicowanie ludzkich komórek nabłonka oskrzeli w dojrzałe fenotypy płuc z linii komórkowych takich jak 16HBE14o-.Komórki nabłonka oskrzeli hodowane przy użyciu technik hodowli komórkowej ALI mogą tworzyć spolaryzowane warstwy komórkowe i ścisłe połączenia, mogą się różnicować i prezentować funkcjonalne rzęski. Metody hodowli komórkowej ALI opierają się na wkładkach do hodowli komórkowej Millicell^® w celu wspierania rozwoju pseudostratyfikowanego fenotypu śluzowo-rzęskowego obserwowanego in vivo. 16HBE14o- ALI References

Rysunek 2. Komórki nabłonka dróg oddechowych hodowane w tradycyjnym 2D (po lewej) vs. 3D interfejsie powietrze-ciecz (ALI) (po prawej). W tradycyjnej hodowli 2D pożywka jest dodawana na wierzchu komórek, dzięki czemu nie są one narażone na działanie powietrza. W hodowli 3D ALI komórki są hodowane na wkładkach i tylko powierzchnia podstawna jest wystawiona na działanie pożywki, podczas gdy strona wierzchołkowa jest wystawiona na działanie powietrza, aby lepiej odwzorować strukturę in vivo.

Protokół hodowli komórek w interfejsie powietrze-ciecz

1. Pokryj kolby do hodowli tkankowych mieszaniną ECM:
   • Fibronektyna (FN) (10 μg/mL, F2006)
   • Kolagen (30 μg/mL, 5006)
   • BSA (100 μg/mL 126575)
   Hodowla i ekspansja komórek 16HBE14o- na kolbach pokrytych ECM w ∝-MEM (M2279), 10% FBS (ES-009-B), 2 mM L-glutaminy (TMS-002-C) i 1X roztwór penicyliny i streptomycyny (TMS-AB2-C). Nie dopuść do nadmiernego zagęszczenia komórek i podziel je po osiągnięciu 90-95% zagęszczenia. Usuń przylegające komórki za pomocą roztworu Trypsyna-EDTA (T3924).
2. Wprowadź komórki 16HBE14o do wiszącej wkładki do hodowli komórkowej Millicell^® (PTHT12H48) w gęstości 10⁵ komórek/cm² w 1-2 ml pożywki wymienionej w kroku 1 powyżej. Zanurzyć komórki na 24 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C. W przypadku protokołów wykorzystujących wkładki stojące Millicell^® , patrz Wskazówki i porady poniżej.
3. Zainicjuj hodowlę z interfejsem powietrze-ciecz, przenosząc wkładkę hodowlaną/komórki do nowej 12-dołkowej płytki (CLS353043). Całe podłoże hodowlane we wkładzie można usunąć, wystawiając komórki na działanie powietrza. Codziennie zmieniaj pożywkę po stronie bazolateralnej wkładki.
4. W dniu 8 lub później komórki mogą być analizowane przy użyciu popularnych testów komórkowych lub barwienia przeciwciał.

Rysunek 3. Hodowla ALI ludzkich komórek nabłonka oskrzeli 16HBE14o. Komórki 16HBE14o wykazują biegunowość (niebieski), wewnątrzkomórkowe ścisłe połączenia ZO-1 (czerwony, AB2272) i ekspresję CFTR (zielony, MAB3484) z funkcją bariery nabłonkowej podczas hodowli na granicy powietrze-ciecz (ALI) (czerwony i niebieski).

Tips & Tricks for Performing 16HBE14o- ALI using Millicell^® Standing Cell Culture Inserts

Ten protokół może być również wykonywany na stojących wkładach do hodowli komórkowych Millicell^®. Wkładka membranowa z poliwęglanu o długości 0,4 m (PIHP01250) jest optycznie półprzezroczysta, ale komórki można obrazować, usuwając membranę z wkładki za pomocą ostrza skalpela nr. 11. Hydrofilowa membrana PTFE 0,4 µm (PICM01250) jest optycznie przezroczysta i może być obrazowana bezpośrednio z wkładki.

1. Dzień przed posianiem komórek, umieść stojące wkładki Millicell^® w 24-dołkowych płytkach do hodowli komórkowych Falcon^® (CLS353047) i pokryć wierzchołkową stronę membrany (PIHP01250) 150 µL mieszaniny ECM. W przypadku hydrofilowych membran PTFE (PICM01250) zalecamy 60 µL mieszaniny rozcieńczonego kolagenu (mieszanina kolagenu i etanolu).
2. Umieść powlekane wkładki w nowej 24-dołkowej płytce i wysiej 200 μL komórek 16HBE14o (1,33 x10⁵ komórek/cm²) po stronie wierzchołkowej. Dodaj 400 µL pożywki do strony podstawno-bocznej. Dodaj dodatkowe 200 µL pożywki do strony wierzchołkowej następnego dnia.
   Uwaga: Zalecamy użycie Millicell^® DCI. do monitorowania wzrostu komórek na przezroczystej membranie PTFE (PICM01250) w ciągu pierwszych 4 dni hodowli komórkowej. Pełne pokrycie należy zaobserwować przed rozpoczęciem ALI.
3. Cztery dni po wysianiu komórek, rozpocznij Dzień 0 ALI, usuwając pożywkę ze strony wierzchołkowej, wystawiając komórki na działanie powietrza. Zmniejsz objętość pożywki podstawno-bocznej do 250 µL, aby zapobiec unoszeniu się komórek na wodzie.
4. Wymieniaj pożywkę podstawno-boczną co drugi dzień przez maksymalnie 14 dni.
5. Pomiar TEER wykonuj co drugi dzień, począwszy od dnia 0 ALI. Utrwal komórki 4% formaldehydem (47608) do obrazowania konfokalnego i barwienia immunologicznego w dniach 1, 8 i 14 ALI. Przeprowadzić testy przepuszczalności żółcieni lucyferowej (LY) w dniach 0, 8 i 14 ALI. Aby zmierzyć TEER i wykonać testy LY, umieść wkładki w nowej 24-dołkowej płytce i dodaj świeżą pożywkę o temperaturze pokojowej:
   • Dla TEER dodać 400 µL pożywki po stronie wierzchołkowej i 600 µL po stronie podstawno-bocznej. Najlepszą praktyką jest pomiar TEER jak najszybciej po dodaniu objętości apikalnej.
   • Dla testów LY, dodaj 400 µL pożywki po stronie apikalnej i 400 µL po stronie basolateralnej. 

.

Komórkowy model mukowiscydozy i funkcji CFTR

Mukowiscydoza to dziedziczna choroba atakująca wiele układów narządów, w tym płuca i układ pokarmowy. Zaburzenie to charakteryzuje się nieprawidłowościami w gruczołach produkujących śluz, co skutkuje wydzielinami zakłócającymi drogi oddechowe gęstym i lepkim śluzem, który zatyka płuca i może prowadzić do śmierci. Białko CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) pomaga utrzymać równowagę soli i wody w organizmie, w tym na powierzchni płuc. Mutacje lub brak genu CFTR mogą prowadzić do mukowiscydozy.

Linia komórkowa 16HBE14o- (SCC150) jest linią komórkową nabłonka dróg oddechowych typu dzikiego i wyraża wysoki poziom CFTR mRNA i białka. Macierzysta linia komórkowa CFBE41o- (SCC151) pochodzi od pacjenta z mukowiscydozą homozygotyczną dla mutacji CFTR ΔF508. Kolejne klony tej linii zostały stworzone z poprawioną mutacją ΔF508 CFTR (SCC158-SCC161).

Andersson C, Al-Turkmani MR, Savaille JE, Alturkmani R, Katrangi W, et al. 2008. Cell culture models demonstrate that CFTR dysfunction leads to defective fatty acid composition and metabolism. J Lipid Res. 49(8):1692-700

Muir A, Soong G, Sokol S, Reddy B, Gomez MI, et al. 2004. Toll-like receptors in normal and cystic fibrosis airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 30(6):777-83.

Luciani A, Villella VR, Esposito S, Brunetti-Pierri N, Medina D, et al. 2010. Defekt CFTR indukuje powstawanie agresomów i zapalenie płuc w mukowiscydozie poprzez hamowanie autofagii za pośrednictwem ROS. Nat Cell Biol. 12(9):863-75.

16HBE14o- Cystic Fibrosis References

Cytokeratyna 18

Pan-Cytokeratyna

Szczelne połączenia ZO-1

CFTR (WT)

Rysunek 4. Charakterystyka przeciwciał linii komórkowej 16HBE14o-. Od lewej do prawej: Komórki 16HBE14o- wyrażają kluczowe markery nabłonka płuc cytokeratynę 18, pan-cytokeratynę (zielony, MAB3412), tworzą ścisłe połączenia, co wykazuje białko TJ ZO-1 (czerwony).), tworzą ścisłe połączenia, o czym świadczy białko TJ ZO-1 (czerwony, AB2272) i wyrażają CFTR typu dzikiego (zielony, MAB3484).

Rysunek 5. Ekspresja genu CFTR w liniach komórkowych nabłonka oskrzeli. Komórki 16HBE14o- wykazują ekspresję genu CFTR typu dzikiego, podczas gdy CFBE41o- i 1HAEo- nie wykazują ekspresji genu CFTR. Linie komórek CFBE41o- pochodzą od pacjenta z mukowiscydozą, który nie wykazuje ekspresji genu CFTR typu dzikiego. Wygenerowano cztery klony z poprawioną mutacją (4.7N, delta F4.7, 6.2N i delta F6.2).

Mechanizmy chorób wirusowych układu oddechowego (H1N1, SARS-CoV, COVID-19)

Komórki nabłonka oskrzeli tworzą funkcjonalną barierę wzdłuż głównych dróg oddechowych do płuc, stanowiąc krytyczną linię obrony przed patogenami układu oddechowego (w tym grypą H1N1, SARS-CoV, MERS-CoV, RSV i COVID-19). Linia komórkowa 16HBE14o- została wykorzystana do zbadania i scharakteryzowania wielu mechanizmów infekcji wirusowej w celu wsparcia badań nad rozwojem szczepionek i leków. Na przykład, komórki 16HBE14o- wyrażają enzym konwertujący angiotensynę 2 (ACE2) i proteazę serynową TMPRSS2, które odgrywają istotną rolę w infekcji SARS-CoV i replikacji wirusa.

Kam YW, Okumura Y, Kido H, Ng LF, Bruzzone R, Altmeyer R. 2009. Cleavage of the SARS coronavirus spike glycoprotein by airway proteases enhances virus entry into human bronchial epithelial cells in vitro. PLoS One. 4(11):e7870.2

Wu XL, Ju DH, Chen J, Yu B, Liu KL, He JX, et al. 2003. Mechanizm immunologiczny alkoholu paczuli przeciwko wirusowi grypy H1N1 może poprzez regulację szlaku sygnałowego RLH in vitro. Curr Microbiol. 67(4):431-6.

Qin L, Peng D, Hu C, Xiang Y, Zhou Y, et al. 2014. Różnicowanie podgrup Th hamowane przez niestrukturalne białka syncytialnego wirusa oddechowego jest pośredniczone przez ubikwitynację. PLoS One. 9(7):e101469.

16HBE14o- Virus References

ACE2 DAPI

TMPRSS2 DAPI

Rysunek 6. Komórki 16HBE wykazują ekspresję ACE-2 i TMPRSS2. Od lewej do prawej: Komórki 16HBE14o hodowane przy użyciu techniki air-liquid-interface (ALI) przez 8 dni wykazują ekspresję enzymu konwertującego angiotensynę 2 (ACE2) i proteazy serynowej TMPRSS2, które odgrywają istotną rolę w infekcji SARS-CoV (COVID-19) i replikacji wirusa.

Modele komórkowe do badań nad astmą i POChP

Astma oskrzelowa i przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP) to obturacyjne choroby płuc charakteryzujące się zapaleniem dróg oddechowych, które może prowadzić do trudności w oddychaniu, nadprodukcji śluzu i uszkodzenia płuc. Linie komórkowe 16HBE14o zostały wykorzystane w modelach komórkowych do badania rekrutacji komórek zapalnych, aktywacji i podstawowych mechanizmów w badaniach nad astmą i POChP.

Hackett TL, de Bruin HG, Shaheen F, van den Berge M, van Oosterhout AJ, et al. 2013. Caveolin-1 kontroluje funkcję bariery nabłonkowej dróg oddechowych. Implikacje dla astmy. Am J Respir Cell Mol Biol. 49(4):662-71.

Leino MS, Loxham M, Blume C, Swindle EJ, Jayasekera NP, et al. 2013. Barrier disrupting effects of Alternaria alternata extract on bronchial epithelium from asthmatic donors. PLoS One. 8(8):e71278.

Pace E, Ferraro M, Minervini MI, Vitulo P, Pipitone L, et al. 2012. Beta defensyna-2 jest zmniejszona w centralnych, ale nie w dystalnych drogach oddechowych pacjentów z POChP. PLoS One. 7(3):e33601.

16HBE14o- Asthma/COPD References

Narażenie na zanieczyszczenie powietrza

Narażenie na toksyczne zanieczyszczenia powietrza, takie jak ozon (O3), benzeny i dwutlenek azotu (NO2) z emisji spalin samochodowych i spalania ciekłego gazu ropopochodnego, odgrywa ważną rolę w rozwoju alergicznych chorób dróg oddechowych i raka płuc. Linie komórkowe 16HBE14o- zostały wykorzystane w modelach komórkowych do badania szkodliwego wpływu zanieczyszczenia powietrza na ludzki nabłonek oskrzeli.

Jiang CL, He SW, Zhang YD, Duan HX, Huang T, et al. 2017. Zanieczyszczenie powietrza i zmiany metylacji DNA w raku płuc: Systematyczne i porównawcze badanie. Oncotarget. 8(1):1369-1391

Zhou Z, Liu Y, Duan F, Qin M, Wu F, et al. 2015. Transcriptomic Analyses of the Biological Effects of Airborne PM2.5 Exposure on Human Bronchial Epithelial Cells. PLoS One. 10(9):e0138267.

Marano F, Boland S, Bonvallot V, Baulig A, Baeza-Squiban A. 2002. Ludzkie komórki nabłonka dróg oddechowych w hodowli do badania molekularnych mechanizmów odpowiedzi zapalnej wywołanej przez cząstki spalin z silników Diesla. Cell Biol Toxicol. 18(5):315-20.

16HBE14o- Air Pollution References

.Wpływ palenia i vapingu na funkcjonowanie płuc

Wykazano, że uszkodzenia spowodowane paleniem tradycyjnych papierosów i e-papierosów (vaping) zwiększają przypadki zapalenia i uszkodzenia nabłonka oraz zakłócają funkcje obronne nabłonka dróg oddechowych. Dodatkowo, dym papierosowy może upośledzać funkcję bariery nabłonkowej dróg oddechowych i przyczyniać się do rozwoju raka płuc. Linie komórkowe 16HBE14o zostały wykorzystane w modelach komórkowych do badania szkodliwego wpływu palenia papierosów i vapingu na ludzkie komórki nabłonka dróg oddechowych.

Heijink IH, Brandenburg SM, Postma DS, van Oosterhout AJ. 2012. Cigarette smoke impairs airway epithelial barrier function and cell-cell contact recovery. Eur Respir J. 39(2):419-28.

Hodge S, Hodge G, Ahern J, Jersmann H, Holmes M, et al. 2007. Palenie zmienia rozpoznawanie makrofagów pęcherzykowych i zdolność fagocytarną: implikacje w przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc. Am J Respir Cell Mol Biol. (6):748-55.

Gerloff J, Sundar IK, Freter R, Sekera ER2, Friedman AE. 2017. Odpowiedź zapalna i dysfunkcja bariery przez różne substancje chemiczne aromatyzujące e-papierosy zidentyfikowane za pomocą chromatografii gazowej-spektrometrii masowej w e-cieczach i e-parach na ludzkich komórkach nabłonka płuc i fibroblastach. Appl In Vitro Toxicol. 3(1):28-40.

16HBE14o- Smoking/Vaping References