Protokoły powlekania ECM dla Millicell^®

Pokrycie membran i powierzchni z tworzyw sztucznych dodatkowymi matrycami komórkowymi (ECM) sprzyja przyłączaniu komórek i tworzeniu monowarstw. Opracowaliśmy protokoły dla czterech rodzajów ECM na wkładkach Millicell^®-CM. Są one również przydatne do hodowli komórek na plastikowych tackach w eksperymentach ko-kultury.

Powłoka z kolagenu typu 1

Materiały

• Wkładki i płytki Millipore^®.
• 70% etanol
• Rat Tail Collagen, Type 1, około 3 mg/ml (Millipore cat. nr kat. 08-115)
• Sterylne strzykawki i końcówki do pipet

Uwaga: Można również użyć alternatywnego źródła kolagenu (typ I) o odpowiednim stężeniu rozcieńczonego w 0,01 N HCl lub kwasie octowym.

Metoda

1. Rozcieńczyć kolagen w stosunku 1:4 w 70% etanolu (1 część kolagenu i 3 części 70% etanolu) i worteksować aż do rozpuszczenia kolagenu.
2. Zbierz odpowiednią liczbę wkładek lub płytek Millicell^®.
3. Używając sterylnej strzykawki z pipetą, dodać odpowiednią objętość mieszaniny kolagenu i etanolu do każdej studzienki.
4. Delikatnie wstrząsać płytką do hodowli komórkowej, aż mieszanina kolagenu i etanolu równomiernie pokryje wnętrze wkładki.
5. Wysuszyć wkładki w suszarce z przepływem laminarnym. Pozostawić uchyloną pokrywę płytki do hodowli komórkowej, aby umożliwić przepływ powietrza i zapobiec kondensacji. Uwaga: Chociaż suszenie trwa zwykle od 3 godzin do nocy, zaleca się suszenie przez noc.
6. Nanieść na wkładkę Millicell^® odpowiednią gęstość komórek (na przykład komórki MDCK: około 5×10⁴ do 5×10⁵ komórek/cm²).

Objętości dla urządzenia powlekającego Millicell^®

* Może być stosowany na każdej membranie Millicell® *Matrigel jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy Becton, Dickinson and Company

Powłoka	(24-dołkowy)	(12-dołkowy)	(6-dołkowy)	(MIllicell 24)	(MIllicell 96)
Kolagen (mieszanina kolagenu i etanolu)	50 µL	150 µL	400 µL	100 µL	25 µL
Fibronektyna* (mieszanina Fibronektyna/DMEM)	100 µL	300 µL	700 µL	200 µL	50 µL
Laminina* (mieszanina Laminina/DMEM)	100 µL	300 µL	700 µL	200 µL	50 µL
Matrigel* (Matrigel/H2O roztwór)	100 µL	300 µL	700 µL	200 µL	50 µL

Powłoka fibronektynowa

Materiały

• Wkładki i płytki Millicell^®.
• Jałowe strzykawki i końcówki do pipet

Fibronektyna ludzka, 1 mg/ml (numer katalogowy: 08-102) po rekonstytucji.

Metoda

1. Rozcieńczyć fibronektynę w stosunku 1:10 w DMEM bez surowicy (1 część fibronektyny w 9 częściach DMEM) i worteksować aż do rozpuszczenia fibronektyny.
2. Zbierz odpowiednią liczbę wkładek lub płytek Millicell^®.
3. Używając sterylnej strzykawki z pipetą, dodaj odpowiednią objętość mieszaniny fibronektyny i DMEM do każdej studzienki.
4. Delikatnie wstrząsnąć płytką do hodowli komórkowej, aż mieszanina fibronektyny/DMEM równomiernie pokryje wkłady Millicell^®-CM.
5. Wysuszyć wkłady na powietrzu przez noc w laminarnym okapie. Pozostawić uchyloną pokrywę płytki do hodowli komórkowej, aby umożliwić przepływ powietrza i zapobiec kondensacji. Uwaga: Chociaż suszenie trwa zwykle od 3 godzin do nocy, zaleca się suszenie przez noc
6. Nasmaruj wkładkę Millicell^® odpowiednią gęstością komórek (na przykład komórki MDCK: około 5×10⁴ do 5×10⁵ komórek/cm²).

Powłoka lamininowa

Materiały

• Wkładki i płytki Millicell^®.
• Jałowe strzykawki i końcówki do pipet

Laminina, 1 mg/ml.

Metoda

1. Rozcieńczyć lamininę w stosunku 1:10 w DMEM (1 część lamininy w 9 częściach DMEM) i worteksować aż do rozpuszczenia lamininy.
2. Zbierz odpowiednią liczbę wkładek lub płytek Millicell^®.
3. Używając sterylnej strzykawki z pipetą, dodać odpowiednią objętość mieszaniny lamininy i DMEM do każdej studzienki.
4. Delikatnie wstrząsać płytką do hodowli komórkowej, aż mieszanina lamininy i DMEM równomiernie pokryje wkładki Millicell^®.
5. Wysuszyć wkładki przez noc w komorze laminarnej. Pozostawić uchyloną pokrywę płytki do hodowli komórkowej, aby umożliwić przepływ powietrza i zapobiec kondensacji. Uwaga: Chociaż suszenie trwa zwykle od 3 godzin do nocy, zaleca się suszenie przez noc.
6. Nanieś na płytkę Millicell^® odpowiednią gęstość komórek (na przykład komórki MDCK: około 5×10⁴ do 5× 10⁵ komórek/cm²).

Powłoka Matigel

Materiały

• Wkładki i płytki Millicell^®.
• Jałowe strzykawki i końcówki do pipet

Metoda

1. Rozcieńczyć Matrigel zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Zbierz odpowiednią liczbę wkładek lub płytek Millicell^®.
3. Używając sterylnej strzykawki z pipetą, dodać odpowiednią objętość mieszaniny Matrigel do każdej studzienki.
4. Delikatnie wstrząsać płytką do hodowli komórkowej, aż roztwór Matrigel równomiernie pokryje wkładkę Millicell^®.
5. Wysuszyć wkładki przez noc w laminarnym okapie. Pozostawić uchyloną pokrywę płytki do hodowli komórkowej, aby umożliwić przepływ powietrza i zapobiec kondensacji. Uwaga: Chociaż suszenie trwa zwykle od 3 godzin do nocy, zaleca się suszenie przez noc.
6. Nasiać wkładkę Millicell^®-CM odpowiednią gęstością komórek (na przykład komórki MDCK: około 5×10⁴ do 5×10⁵ komórek/cm²).