Biotyna w hodowli komórkowej

Znaczenie i zastosowanie biotyny w hodowlach eukariotycznych bez surowicy, w tym hybrydoma i komórek jajnika chomika chińskiego (CHO)

.Biotyna, zarówno jako klasyczna pożywka jak i pożywka bez surowicy Suplement pożywki, przydatny w biomanufakturowaniu, inżynierii tkankowej i pożywkach specjalnych:

Biotyna jest ważną witaminą rozpuszczalną w wodzie, występującą w wielu pożywkach. Mogą one obejmować pożywki niezawierające surowicy stosowane w biomanufakturowaniu, inżynierii tkankowej, produkcji szczepionek i innych komercyjnie użytecznych zastosowaniach.

Biotyna znajduje się w wielu klasycznych pożywkach, w tym: Ames' Medium; Basal Medium Eagle (BME); BGJb Medium Fitton-Jackson Modification; CMRL-1066 Medium; DMEM/Ham's Nutrient Mixture F-12 (50:50); EMEM-alfa; F-12 Coon's Modification; Fischer's Medium; H-Y Medium (Hybri-Max^®); Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM); McCoy's 5A Modified Medium; MCDB Medium; Medium 199; NCTC Medium; Nutrient Mixtures, Ham's F-10; Nutrient Mixtures, Ham's F-12; Nutrient Mixture Ham's F-12 Kaighn's Modification (F12K); RPMI-1640;  Serum-Free/Protein Free Hybridoma Medium; Waymouth Medium MB; Williams Medium E i różne media specjalne.

Należy zauważyć, że podłoża hodowlane które nie zawierają biotyny są generalnie oparte na Minimum Essential Medium Eagle (EMEM) i obejmują: Click's Medium; Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM); Glascow Minimum Essential Medium (GMEM); oraz Swim's S-77 Medium. IMDM i EMEM-alpha są wyjątkami zawierającymi biotynę. Pożywka L-12 również nie zawiera biotyny.

Podstawowe klasyczne pożywki stosowane w opracowywaniu preparatów bez surowicy do biomanufaktury białek heterologicznych i innych zastosowań komercyjnych zazwyczaj zawierają biotynę albo jako część macierzystego preparatu, albo jako nowy dodatek do zastrzeżonej lub specjalistycznej pożywki.

Suplementacja pożywek biotyną do hodowli komórek eukariotycznych bez surowicy jest skomplikowana ze względu na fakt, że biotyna jest podatna na stres oksydacyjny i inaktywację przez promieniowanie UV. Dlatego też skuteczne stosowanie biotyny w pożywkach do hodowli komórek wymaga zrozumienia jej właściwości chemicznych. Pełniejsze omówienie biotyny jako suplementu do hodowli komórkowych suplementu medialnego można znaleźć na stronie Media Expert.

Podstawowe funkcje biotyny w pożywkach do hodowli komórkowych:

Biotyna jest niezbędną witaminą, która jest ważna dla metabolizmu aminokwasów i energii oraz syntezy kwasów tłuszczowych. Jest grupą prostetyczną w czterech rodzinach karboksylaz ssaków i ułatwia wiązanie i przenoszenie dwutlenku węgla. Enzymy zawierające biotynę to karboksylaza pirogronianowa (EC 6.4.1.1), karboksylaza acetylo-CoA (EC 6.4.1.2), karboksylaza metylokrotonylo-CoA (EC 6.4.1.4) i karboksylaza proprionylo-CoA (EC 6.4.1.3). Wszystkie cztery enzymy są napędzane przez ATP. Karboksylaza pirogronianowa i karboksylaza acetylo-CoA są ważne dla syntezy kwasów tłuszczowych. Karboksylaza metylokrotonylo-CoA i karboksylaza proprionylo-CoA biorą udział w degradacji odpowiednio leucyny i metioniny, izoleucyny i homocysteiny.

Znaczenie in vitro:

Przy braku biotyny komórki ssaków nie mogą syntetyzować kwasów tłuszczowych. Sprawia to, że komórki te są zależne od zewnętrznych źródeł kwasów tłuszczowych, w tym rodziny palmitoilowych kwasów tłuszczowych. Nie mogą przekształcić metioniny, izoleucyny, homocysteiny lub leucyny w produkty pośrednie cyklu TCA i nie mogą przekształcić nadmiaru pirogronianu w kwasy tłuszczowe.

Biotin Protein Cycle:

Karboksylazy są syntetyzowane jako apokarboksylazy. Biotyna jest dodawana do karboksylaz przez syntetazy holokarboksylazy biotyny, takie jak syntetazy holokarboksylazy biotyny (EC 6.3.4.10). Syntetazy te przyłączają biotynę do grupy aminowej epsilon lizyny i tworzą resztę aminokwasową epsilon-N-biotynylo-L-lizylową. Gdy białka karboksylazy są degradowane, ten aminokwas, znany również jako biotyna, jest uwalniany. Biotyna może być uwalniana z biocytyny przez wszechobecny w komórkach ssaków enzym zwany biotynidazą (EC 3.5.1.12). Biotynidazy mogą pełnić dodatkowe funkcje związane z transportem i wykorzystaniem biotyny w komórkach.

Biotynylacja białek i poliamin:

Biotyna może odgrywać rolę w regulacji transkrypcji i naprawy DNA. W pewnych warunkach enzym biotynidaza wydaje się funkcjonować jako transferaza biotyny i przenosić biotynę na reszty lizylowe histonów i poliamin. Histony są ważnymi białkami, które wpływają na strukturę chromatyny i dostęp do DNA przez białka regulatorowe i naprawcze. Biotynylacja histonów może odgrywać rolę w wyciszaniu genów i odpowiedzi komórkowej na uszkodzenia DNA. Poliaminy są zaangażowane w ważne funkcje mitochondriów.

Biotyna i histony poza jądrem mają pewne działania podobne do insuliny. Zwiększają wychwyt glukozy i stymulują syntezę cGMP oraz tworzenie podtlenku azotu. Biotyna może indukować glukokinazę.

Chemiczne właściwości biotyny, które sprawiają, że jest ona przydatnym suplementem diety bez surowicy

Biotyna:

Witamina H, koenzym R

Biotyna ma atom siarki w swoim pierścieniu jak tiamina i poprzeczne wiązanie w poprzek pierścienia. Biotyna ma trzy asymetryczne węgle i może występować jako osiem różnych izomerów. Tylko izomer d-(+)-biotyny, D-biotyna jest biologicznie aktywny.

Formuła: C₁₀H₁₆N₂O₃S

Masa cząsteczkowa: 244,31

PH izoelektryczne = 3.5

Biotyna jest:

• rozpuszczalna w wodzie;
• rozpuszczalna w rozcieńczonych alkaliach i gorącej wodzie;
• stosunkowo stabilna w kwaśnym i obojętnym zakresie pH

Biocytyna:

Swobodnie rozpuszczalna w wodzie

Prekursorowa forma biotyny, przekształcana w biotynę przez biotynazę.

Stabilność biotyny:

Biotyna jest stosunkowo stabilną witaminą w warunkach fizjologicznych, ale może być podatna na elementy stresu oksydacyjnego. Nadtlenione nienasycone kwasy tłuszczowe lub ekspozycja na promieniowanie ultrafioletowe mogą inaktywować biotynę. Częściowa ochrona przez witaminę E sugeruje, że inaktywacja ta prawdopodobnie zachodzi w wyniku ataku wolnych rodników na biotynę za pośrednictwem kwasów tłuszczowych. Najbardziej podatnym miejscem jest prawdopodobnie atom siarki. Produktami utleniania biotyny są sulfotlenek biotyny i sulfon biotyny. Inne czynniki, które mogą być nieaktywne dla biotyny to formaldehyd, kwas azotawy i cholina.

Produkty biotyny, które zwiększają wzrost komórek Hybridoma, komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) i innych komórek eukariotycznych ssaków w hodowlach bez surowicy: