Wapń w hodowli komórkowej
Dennis R. Conrad, PhD
Znaczenie i zastosowanie wapnia w hodowlach komórek eukariotycznych, w tym hybrydoma i komórek jajnika chomika chińskiego (CHO).
Dlaczego warto stosować wapń w hodowlach komórkowych?
Wapń jest jonowo stabilnym dwuwartościowym kationem o zarówno korzystnych, jak i toksycznych właściwościach w komórkach podłożach do hodowli.
Stężenie wapnia w klasycznych pożywkach i ich pochodnych waha się od 0 w BGJb Medium Fitton-Jackson Modification, opracowanym do hodowli chrzęstnej kości embrionalnej, do 2 mM w pożywce MCDB 201, opracowanej do hodowli Chick Embryo Fibroblasts, dołączonej linii komórkowej. Zasadniczo najwyższe stężenia wapnia występują w pożywkach uzupełnionych surowicą, takich jak FBS, klasyczne pożywki opracowane dla dołączonych typów komórek. Surowica ogólnie chroni komórki przed uszkodzeniami oksydacyjnymi. Poziomy wapnia są ogólnie niższe w pożywkach bez surowicy i pożywkach opracowanych do hodowli komórek pierwotnych i klonalnych. Może to wynikać z faktu, że komórki pierwotne i komórki hodowane w gęstościach klonalnych są podatne na toksyczny napływ wapnia przez błony komórkowe uszkodzone w wyniku procesów oksydacyjnych, przeważających w podłoża hodowlane oraz przetwarzanie enzymatyczne i mechaniczne. Ponieważ wapń wpływa na sygnalizację komórkową i różnicowanie, a także na przyczepność komórek, pożywki opracowane dla określonych typów komórek mogą wymagać znacznie obniżonych poziomów wapnia.
Następujące klasyczne pożywki zawierają 1.8 mM wapnia: Basal Medium Eagle (BME); CMRL-1066 Medium; Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM); Glascow Minimum Essential Medium, GMEM; H-Y Medium (Hybri-Max®); Medium 199; Minimum Essential Medium Eagle (EMEM); NCTC Medium; Swim's S-77 Medium; i Williams Medium E. Click's Medium; MCDB media 131 i Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) zawierają nieco mniej wapnia, odpowiednio 1,67, 1,60 i 1,49 mM.
L-15 Medium i Ames' Medium zawierają odpowiednio 1,26 i 1,15 mM wapnia.15 mM wapnia, odpowiednio.
DMEM/Ham's Nutrient Mixture F-12 (50:50) jest często używana jako pożywka bazowa do opracowywania zastrzeżonych i specjalistycznych pożywek do hodowli komórek CHO do produkcji biomateriałów. Pożywka ta zawiera 1,05 mM wapnia, co jest bardzo zbliżone do poziomu wapnia w pożywkach MCDB 105 i 110 na poziomie 1,0 mM. Pożywka MCDB została opracowana do klonalnego wzrostu ludzkich komórek diploidalnych. Inne klasyczne pożywki opracowane do hodowli komórek pierwotnych, takie jak Nutrient Mixture Ham's F-12 Kaighn's Modification (F12K) (0,92 mM); McCoy's 5A Modified Medium (0.9 mM) i Waymouth Medium MB (0,82 mM) również zawierają blisko 1 mM wapnia.
MCDB medium 302 opracowane dla komórek CHO zawiera 0,60 mM wapnia. Mieszanki składników odżywczych, Ham's F-10 i F-12 oraz Serum-Free/Protein Free Hybridoma Medium (które jest oparte na F-12) zawierają 0,30 mM wapnia. RPMI-1640 zawiera 0,42 mM wapnia. Stężenie wapnia stosowane w pożywkach do hodowli CHO waha się od 0,30 do 1,05 mM. Podłoże DMEM//F-12 (50:50) z 1,05 mM wapnia jest częściej stosowane jako podstawa do rozwoju pożywek CHO stosowanych w biomanufacturingu.
Podłoże MCDB 151 i 153 opracowane dla keratynocytów zawierają bardzo niskie poziomy wapnia w zakresie 0,03 mM. Bardzo niskie poziomy wapnia stosowane w keratynocytach ujawniają, że wapń może mieć istotny wpływ regulacyjny lub różnicujący na określone typy komórek.
Zarządzanie dostarczaniem wapnia jest złożonym, ale ważnym wymogiem dla rozwoju podłoży do hodowli oraz systemów do biomanufaktury i inżynierii tkankowej. Niewłaściwe zarządzanie wapniem może wpływać na przywiązanie, stan różnicowania i żywotność hodowanych komórek. Pełniejsze omówienie wapnia jako dodatku do komórek podłoża do hodowli znajduje się poniżej.
Podstawowe funkcje wapnia w podłożach do hodowli komórkowych
.Wapń bierze udział w wielu istotnych funkcjach komórek, w tym w aktywności enzymów, przyłączaniu, ruchliwości, morfologii tkanek, procesach metabolicznych, przekazywaniu sygnałów, replikacji i reakcjach elektrochemicznych wyspecjalizowanych komórek, takich jak komórki mięśniowe i nerwowe. Jest on przechowywany głównie w retikulum endoplazmatycznym (ER). Białka wiążące wapń w świetle ER obejmują izomerazę disiarczkową białka, kalretikulinę, endoplazminę i retikulokalbinę. Komórki zawierają wiele białek wiążących wapń spoza światła ER, które pośredniczą w aktywności komórkowej i kaskadach sygnalizacyjnych. Przykłady tych białek obejmują kalbindyny, troponinę C, kalmodulinę i białka S-100.
Sygnał komórkowy wapnia
Wapń jest zaangażowany na kilku poziomach w transdukcję sygnału za pośrednictwem receptora. Ułatwia wiązanie kinazy białkowej C z błonami komórkowymi, a po uwolnieniu z ER przez 1,4,5-trifosforan inozytolu wiąże i aktywuje kalmodulinę. Cykliczne nukleotydy, cAMP i cGMP, działają jako drugie przekaźniki. Aktywowana kalmodulina reguluje enzymy cyklazy i fosfatazy, które kontrolują wewnątrzkomórkowe pule tych nukleotydów. Aktywowana kalmodulina reguluje również kinazy białkowe i fosfatazy zaangażowane w progresję cyklu komórkowego
Przyczepność komórek i morfologia tkanek
Wapń ułatwia przyczepianie się komórek do substratów i do siebie nawzajem oraz pośredniczy w wielu zdarzeniach komórkowych, które wpływają na ruch komórek, ich kształt i trójwymiarową strukturę. Moduluje on funkcje kadheryn, selektyn i integryn. Te rodziny cząsteczek adhezyjnych regulują odpowiednio interakcje homologiczne komórka-komórka, heterologiczne komórka-komórka i komórka-matryca. Wapń jest również zaangażowany w sygnalizację zdarzeń przyłączania z wnętrza światła ER.
Calcium Cycling
Zdrowe komórki utrzymują duży gradient stężenia między wapniem zewnątrzkomórkowym i wewnątrzkomórkowym. Normalne pozakomórkowe stężenia wapnia mieszczą się w zakresie 1-3 mM, a stężenia wewnątrzkomórkowe mieszczą się w zakresie mikromolarnym, od 0,1 do 0,2 µM. Różnorodne błonowe kanały transportowe regulują homeostazę wapnia i modulują reakcje komórek na bodźce środowiskowe. Uszkodzenie kanałów transportu wapnia lub integralności błony komórkowej powoduje szybki napływ wapnia. Głównym czynnikiem przyczyniającym się do uszkodzenia błony komórkowej jest peroksydacja lipidów, która jest inicjowana przez stres oksydacyjny. Nagromadzenie wapnia wewnątrz komórek pośredniczy w kaskadzie destrukcyjnych zdarzeń, w tym zaburzeń funkcji enzymów, równowagi jonowej i pH oraz zmian w funkcjach krytycznych organelli, takich jak mitochondria. Gdy uszkodzenie błony podnosi wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia powyżej 0,5 µM, mitochondria komórki zaczynają działać w celu usunięcia wapnia z cytoplazmy.
W transporcie wapnia z cytoplazmy do mitochondriów pośredniczy uniporter wapnia, który jest napędzany przez potencjał błony wewnętrznej mitochondriów. Ten potencjał błonowy jest ustalany przez różnicę pH, która istnieje między macierzą mitochondrialną a mitochondrialną przestrzenią międzybłonową. Gdy wapń dostaje się do macierzy przez uniporter, obniża potencjał błonowy. Mitochondria normalnie usuwają wapń z macierzy za pomocą kilku transporterów. Należą do nich niewrażliwy na sód transporter o niskiej pojemności; transporter sodu/wapnia i pory przejścia fazowego o wysokiej przewodności. Pory przejścia fazowego o wysokiej pojemności mogą otwierać się częściowo i odwracalnie lub całkowicie i nieodwracalnie. Gdy poziom wapnia w macierzy mitochondrialnej gwałtownie wzrasta podczas procesów sygnalizacji komórkowej, zwiększone stężenie wapnia w macierzy powoduje otwarcie porów o wysokiej pojemności na dyfuzję jonów. Gdy pory te są otwarte, wapń może wydostać się z macierzy mitochondrialnej, a protony mogą dostać się do macierzy. Prowadzi to do tymczasowej depolaryzacji wewnętrznej błony mitochondrialnej. Wzrost pH wewnątrz macierzy powoduje zamknięcie porów o wysokiej pojemności, a łańcuch transportu elektronów przywraca potencjał błony. Synteza ATP może zachodzić tylko wtedy, gdy potencjał błony zostanie przywrócony. Przepływ wapnia przez mitochondria jest normalną i niezbędną reakcją fizjologiczną na bodźce mobilizujące wapń. Służy on wielu celom. Pomaga buforować wpływ wapnia w cytoplazmie poprzez szybkie usuwanie go, gdy stężenie przekracza około 500 nM. Wewnątrzmitochondrialny wapń aktywuje kilka enzymów cyklu TCA i stymuluje zwiększoną produkcję energii.
Paradoks wapnia i apoptoza
Komórki są normalnie narażone na stężenia wapnia w mM bez toksycznych konsekwencji. Gdy pozakomórkowy wapń zostanie usunięty z komórek na pewien czas, a następnie komórki zostaną ponownie wystawione na działanie wapnia, czasami dochodzi do rozległych uszkodzeń i śmierci komórek. Paradoks ten można wyjaśnić faktem, że dzieje się to w okolicznościach, w których komórki są również poddawane warunkom uszkadzającym błony komórkowe. Zjawisko to jest często obserwowane, gdy tkanki są ponownie natleniane po niedotlenieniu. Oksydacyjne uszkodzenie błon komórkowych jest prawdopodobnie częstym mediatorem tego efektu. Chelatory wapnia, takie jak EDTA, są często stosowane podczas trypsynizacji komórek. Uszkodzenie błon komórkowych w wyniku działania trypsyny i utleniania może sprawić, że komórki te będą podatne na śmierć komórkową za pośrednictwem wapnia, gdy zostaną ponownie zawieszone w pożywce zawierającej wapń. Stężenie wapnia w pożywce zwykle mieści się w zakresie mM, a uszkodzenie błony komórkowej w wyniku uszkodzenia mechanicznego lub chemicznego może prowadzić do wycieku wapnia do komórki. Gdy wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia przekroczy 500 nM, mitochondria aktywnie go pobierają. Ponieważ pozakomórkowa pula wapnia jest duża, mitochondria nie mogą przywrócić normalnego wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. Gdy mitochondria pobierają wapń, synteza ATP zatrzymuje się, błona wewnątrzmitochondrialna depolaryzuje się, pH matrycy wzrasta, a wiązanie nadmiaru wapnia z porami przejścia błonowego powoduje jego pełne i nieodwracalne otwarcie. Po całkowitym otwarciu się tej pory następuje kaskada zdarzeń, które prowadzą do uwolnienia czynnika indukującego apoptozę i cytochromu c. Ostateczną konsekwencją jest apoptotyczna śmierć komórki.
Chemiczne właściwości wapnia, które czynią go użytecznym Serum-Free Media Supplement
Wapń jest obficie występującym dwuwartościowym metalem ziemskim, który występuje w przyrodzie w wielu stałych formach nieorganicznych. Jest ważnym składnikiem struktur roślinnych i zwierzęcych, takich jak liście, kości, zęby i muszle, i nigdy nie występuje w postaci niezwiązanej.
Największymi problemami chemicznymi związanymi z wapniem w hodowli komórkowej są jego rozpuszczalność i biodostępność. Wapń jest często dodawany do pożywek do hodowli komórkowych jako swobodnie rozpuszczalny chlorek wapnia. W roztworze wapń ulega redystrybucji i łączy się z innymi jonami i cząsteczkami w podłożu. Istnieje wiele jonów i cząsteczek w systemach hodowli komórkowej, z którymi wapń może się wiązać i tworzyć nierozpuszczalne lub słabo rozpuszczalne cząsteczki.
Fosforany wapnia
Fosfor jest powszechnym pierwiastkiem w systemach hodowli komórkowej, który może przyczyniać się do wytrącania wapnia w niektórych warunkach. Nieorganiczny fosfor występuje głównie jako jednozasadowy i dwuzasadowy fosforan w fizjologicznym pH. Przybliżona rozpuszczalność fosforanów wapnia w zimnej wodzie to fosforan jednozasadowy, Ca(H2PO4)2, 71 mM; fosforan dwuzasadowy wapnia, CaHPO4, 1.7 mM i trójzasadowy fosforan wapnia, Ca3(PO4)2, 0,06 mM. Przy pH 7,0 około 61% fosforanu występuje w postaci dwuzasadowej, a przy pH 7,6 wzrasta do około 87%. Rozpuszczalność fosforanu wapnia w tej formie wynosi około 1,7 mM, a najwyższe stężenie zwykle stosowane w preparatach medialnych wynosi 1,8 mM. Sugeruje to, że wytrącanie wapnia przez jony fosforanowe powinno stanowić problem tylko wtedy, gdy pH jest zasadowe podczas czynności takich jak miareczkowanie zasadowe. Powstały w ten sposób trójzasadowy fosforan wapnia spowodowałby wytrącenie i możliwą utratę wapnia podczas filtracji.
Chelatory
Chelatory takie jak cytrynian i EDTA są czasami używane w hodowli komórkowej. EDTA ma logarytm powinowactwa do wapnia wynoszący około 10,6 i jest często stosowany do usuwania wapnia z pożywek do hodowli komórkowych, zwłaszcza gdy komórki są odłączane od substratów lub gdy problemem jest zbrylanie się komórek. Cytrynian i albumina wiążą wapń z powinowactwem logarytmicznym wynoszącym odpowiednio około 3,6 i 2. Cytrynian wiąże się również z albuminą. Razem cytrynian i albumina mogą wiązać znaczną ilość wapnia w systemach hodowli komórkowych.
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?