Ugrás a tartalomra
Merck
Kezdőlapőssejt kultúraIndukált pluripotens őssejt differenciálási protokollok

Indukált pluripotens őssejt differenciálási protokollok

Információ

Mi az indukált pluripotens őssejtek?

A felnőtt szomatikus sejtek átprogramozhatók indukált pluripotens őssejtek (iPSC-k) előállítása a kulcsfontosságú átprogramozó gének (OCT4, KLF4, SOX2, cMYC, NANOG és LIN28) túlreprezentálásával. Az emberi iPSC-k egyedülálló módon képesek a szervezet bármely sejttípusává differenciálódni, beleértve:

  • Ektodermális: Neuron, asztrocita, oligodendrocita, retina epithelsejt (RPE), epidermális, haj- és keratinocita.
  • Endodermális: Hepatocita, hasnyálmirigy β-szigetsejt, bélhámsejt, tüdő alveoláris sejtek.
  • Mezodermális: Vérképzőszervi sejtek, endotélsejtek, kardiomiocita, simaizomsejt, vázizomsejt, vesesejt, adipocita, kondrocita és csontocita.
IPSC útvonal

1. ábra.iPSC útvonal

iPSC Collection

A humán iPSC-k sejtsorsának szabályozására használt sejttenyésztő közegek, kiegészítők, bioaktív kis molekulák és növekedési faktorok nagy gyűjteményét kínáljuk. Az alábbi táblázat kiemeli a humán iPSC-k különböző sejtvonalakká történő differenciálásához használt, legelterjedtebb protokollokat, médiumokat és karakterizáló antitesteket.

Gyakran ismételt kérdések a iPSC-kről

  • Eredményesség és reprodukálhatóság: A fejlődés ellenére az iPSC-k irányítása, hogy meghatározott sejttípusokká differenciálódjanak, még mindig ellentmondásos lehet. A differenciálási protokollok következetességének és megbízhatóságának javítása kulcsfontosságú a szélesebb körű alkalmazásukhoz a kutatásban és a klinikai környezetben. Továbbá, a különböző iPSC-vonalak eltérő hatékonysággal differenciálódhatnak bizonyos csírarétegekké, egyes iPSC-vonalak fokozott differenciálódást mutatnak a mezodermához képest az endodermához képest, és fordítva.
  • A differenciált sejtpopulációk heterogenitása: Még a sikeres differenciálás is gyakran heterogén, eltérő érettségű, funkcionalitású és tisztaságú sejtpopulációkat eredményez. Ennek a heterogenitásnak a kontrollálása és minimalizálása elengedhetetlen ahhoz, hogy egységes és funkcionális sejtpopulációkat kapjunk a későbbi alkalmazásokhoz.
  • Az érettség és a funkcionalitás: Az iPSC-ből származó érett és funkcionális sejtek elérése kihívást jelent. Számos sejttípus éretlen fenotípust vagy funkcionális hiányosságokat mutathat a natív társaihoz képest, ezért a differenciálási protokollok javítása létfontosságú a klinikai transzláció fokozásához.
  • Scale-Up és automatizálás: Skálázható és automatizált differenciálási platformokra van szükség a klinikai alkalmazásokhoz szükséges nagy mennyiségű, konzisztens és jó minőségű sejttermékek előállításához. A szabályozási előírásoknak megfelelő robusztus gyártási folyamatok kifejlesztése kulcsfontosságú a kereskedelmi forgalomba hozatalhoz.
  • Optimalizálja a tenyésztési feltételeket: A táptalaj összetételének finomhangolása, beleértve a növekedési faktorokat, citokineket, kis molekulákat és kiegészítőket, jelentősen befolyásolhatja az őssejtek differenciálódási hatékonyságát és specifitását. A tenyésztési feltételek szisztematikus kísérletezésen és visszajelzésen alapuló iteratív optimalizálása elengedhetetlen a reprodukálható és robusztus differenciálási eredmények eléréséhez.
  • Kifejezetten és kémiailag meghatározott médiumok használata: Az összetett és nem definiált tenyésztési rendszerekről a definiált és kémiailag definiált médiakészítményekre való áttérés csökkenti a variabilitást és fokozza a differenciálódási folyamatok ellenőrzését. A csak jól jellemzett komponenseket tartalmazó, definiált médiakészítmények megkönnyítik a szabványosítást, a skálázhatóságot és a szabályozási megfelelőséget, különösen a klinikai alkalmazások esetében.
  • Biomimetikus tenyésztési rendszerek alkalmazása: A sejtek fiziológiás mikrokörnyezetének utánzása biomimetikus tenyésztési rendszerek, például 3D állványok, organ-on-a-chip platformok és ko-kultúrás rendszerek felhasználásával növeli a in vitro differenciálódási modellek relevanciáját és hűségét. Ezek a rendszerek olyan térbeli jeleket, sejt-sejt kölcsönhatásokat és mechanikai ingereket biztosítanak, amelyek jobban reprodukálják a szöveti architektúrát és funkciót, elősegítve a fiziológiailag relevánsabb differenciálódási eredményeket.

A multimikrobiális megközelítéseket is integrálhat, felhasználhatja az egysejtes elemzést, alkalmazhat genomszerkesztést a precíziós szabályozáshoz, valamint gépi tanulást és adatintegrációt hajthat végre a differenciálási eredmények javítása érdekében. 

Míg a kutatók továbbra is jelentős előrelépéseket tesznek az őssejt-differenciálási protokollok terén, számos gyakori hiba akadályozhatja kísérleteik sikerét és reprodukálhatóságát, például:

  • Az optimalizálás hiánya: A differenciálási protokollok alapos optimalizálásának elmulasztása az adott sejttípusokhoz és kísérleti körülményekhez változó vagy ellentmondásos eredményekhez vezethet. A kutatók figyelmen kívül hagyhatják a különböző tenyésztési feltételek, többek között a növekedési faktorok, citokinek, szubsztrát tulajdonságok és a tenyésztési időtartam szisztematikus tesztelésének fontosságát, hogy meghatározzák a robusztus és reprodukálható differenciálódás optimális feltételeit.
  • Nem megfelelő jellemzés: A differenciált sejtpopulációk elégtelen jellemzése elhomályosíthatja a termelt sejtek heterogenitását, érettségét és funkcionalitását. A kutatók figyelmen kívül hagyhatják az átfogó fenotípusos és funkcionális elemzések szükségességét, beleértve az immunfestést, az áramlási citometriát, a génexpressziós profilok és a funkcionális vizsgálatok elvégzését a differenciált sejtek azonosságának és minőségének validálása érdekében.
  • A heterogenitás kezelésének elmulasztása: A differenciált sejtpopulációkon belüli heterogenitás figyelmen kívül hagyása vagy nem megfelelő kezelése veszélyeztetheti a kísérleti eredmények megbízhatóságát és értelmezhetőségét. A kutatók figyelmen kívül hagyhatják a specifikus sejtalcsoportok tisztításának vagy dúsításának fontosságát, például fluoreszcencia-aktivált sejtválogatás (FACS) vagy mágneses sejtválogatás alkalmazásával, hogy homogén sejtpopulációkat kapjanak a későbbi elemzésekhez vagy alkalmazásokhoz.
  • Gyenge reprodukálhatóság: A kísérleti eljárások, reagenskészítmények és sejtkezelési protokollok dokumentálásának és szabványosításának elhanyagolása akadályozhatja a reprodukálhatóságot a különböző laboratóriumokban vagy kísérletekben. A kutatók figyelmen kívül hagyhatják a részletes nyilvántartások vezetésének, a szabványosított működési eljárások követésének, valamint a protokollok és reagensek tudományos közösséggel való megosztásának jelentőségét a reprodukálhatóság és az átláthatóság elősegítése érdekében.
  • A minőségellenőrzési intézkedések figyelmen kívül hagyása: A minőségellenőrzési intézkedések, például a sejtek életképességének, tisztaságának és sterilitásának a differenciálási folyamat során történő nyomon követése, jelentőségének alábecsülése kísérleti leleteket vagy szennyeződési problémákat eredményezhet. A kutatók figyelmen kívül hagyhatják a rendszeres sejtvonal-hitelesítés, a mikoplazma-vizsgálat és az endotoxin-szűrés szükségességét a sejttenyészetek integritásának és biztonságának biztosítása érdekében.
  • Túlságos megbízás a 2D tenyésztési rendszerekben: Ha kizárólag a hagyományos 2D tenyésztési rendszerekre támaszkodunk anélkül, hogy figyelembe vennénk e platformok korlátait a komplex szöveti architektúra és a mikrokörnyezeti jelzések reprodukálásában, az nem optimális differenciálódási eredményekhez vezethet. A kutatók figyelmen kívül hagyhatják a 3D tenyésztési rendszerek, organoid modellek vagy mikrofluidikai eszközök alkalmazásának előnyeit a in vivo szöveti fiziológia jobb utánzása és a differenciálódás hatékonyságának és funkcionalitásának növelése érdekében.
  • Elégtelen adatelemzés és értelmezés: A nem megfelelő adatelemzés és értelmezés a komplex kísérleti eredmények félreértelmezéséhez vagy túlzott leegyszerűsítéséhez vezethet. A kutatók figyelmen kívül hagyhatják a megfelelő statisztikai módszerek, adatvizualizációs technikák és számítási eszközök alkalmazásának fontosságát a nagydimenziós adathalmazok elemzése és a kísérleteikből származó értelmes meglátások kinyerése érdekében.

A technológia kulcsfontosságú szerepet játszik az őssejt-differenciálási protokollok fejlesztésében és e kísérletek eredményeinek javításában, több szempontból is:

  1. High-Throughput Screening (HTS): A robotikával, folyadékkezelő rendszerekkel és képalkotó eszközökkel felszerelt automatizált platformok lehetővé teszik nagy vegyületkönyvtárak vagy tenyésztési körülmények nagy áteresztőképességű szűrését az őssejt-differenciálódást elősegítő vagy gátló tényezők azonosítása érdekében. A HTS felgyorsítja a differenciálódás hatékonyságát és specifitását fokozó új kis molekulák, növekedési faktorok vagy táptalaj-készítmények felfedezését.
  2. Omics Technologies: A genomika, a transzkriptomika, a proteomika és a metabolizmus terén elért előrelépések lehetővé teszik az őssejtek és differenciált utódaik átfogó profilalkotását molekuláris szinten. A multi-omikai adatok integrálása betekintést nyújt a differenciálódás különböző szakaszaihoz kapcsolódó szabályozó hálózatokba, jelátviteli útvonalakba és kulcsfontosságú biomarkerekbe, ami a differenciálódási protokollok optimalizálásához és a sejtsorsdöntések modulálására szolgáló új célpontok azonosításához vezet.
  3. Genomszerkesztő eszközök: A precíz genomszerkesztési technológiák, mint például a CRISPR-Cas9, lehetővé teszik a génexpresszió, az epigenetikai módosítások és az őssejt-differenciálódásban szerepet játszó jelátviteli útvonalak célzott manipulálását. A genomszerkesztés lehetővé teszi a kutatók számára a kívánt fenotípusos tulajdonságokkal rendelkező őssejtek létrehozását, a differenciálódás hatékonyságának növelését és a genetikai betegségek in vitro modellezését, megkönnyítve ezzel a betegségmechanizmusok tanulmányozását és a személyre szabott terápiák kifejlesztését.
.
Kapcsolódó termékek
Loading

Hivatkozások

1.
Chambers SM, Fasano CA, Papapetrou EP, Tomishima M, Sadelain M, Studer L. 2009. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27(3):275-280. https://doi.org/10.1038/nbt.1529
2.
Shi Y, Kirwan P, Livesey FJ. 2012. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7(10):1836-1846. https://doi.org/10.1038/nprot.2012.116
3.
Ma L, Liu Y, Zhang S. 2011. Directed Differentiation of Dopamine Neurons from Human Pluripotent Stem Cells.411-418. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-201-4_30
4.
Karumbayaram S, Novitch BG, Patterson M, Umbach JA, Richter L, Lindgren A, Conway AE, Clark AT, Goldman SA, Plath K, et al. 2009. Directed Differentiation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells Generates Active Motor Neurons. 27(4):806-811. https://doi.org/10.1002/stem.31
5.
Shaltouki A, Peng J, Liu Q, Rao MS, Zeng X. 2013. Efficient Generation of Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells in Defined Conditions. 31(5):941-952. https://doi.org/10.1002/stem.1334
6.
Douvaras P, Wang J, Zimmer M, Hanchuk S, O’Bara M, Sadiq S, Sim F, Goldman J, Fossati V. 2014. Efficient Generation of Myelinating Oligodendrocytes from Primary Progressive Multiple Sclerosis Patients by Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 3(2):250-259. https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2014.06.012
7.
Burridge PW, Matsa E, Shukla P, Lin ZC, Churko JM, Ebert AD, Lan F, Diecke S, Huber B, Mordwinkin NM, et al. 2014. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11(8):855-860. https://doi.org/10.1038/nmeth.2999
8.
Maffioletti SM, Gerli MFM, Ragazzi M, Dastidar S, Benedetti S, Loperfido M, VandenDriessche T, Chuah MK, Tedesco FS. 2015. Efficient derivation and inducible differentiation of expandable skeletal myogenic cells from human ES and patient-specific iPS cells. Nat Protoc. 10(7):941-958. https://doi.org/10.1038/nprot.2015.057
9.
Patsch C, Challet-Meylan L, Thoma EC, Urich E, Heckel T, O’Sullivan JF, Grainger SJ, Kapp FG, Sun L, Christensen K, et al. 2015. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nat Cell Biol. 17(8):994-1003. https://doi.org/10.1038/ncb3205
10.
Si-Tayeb K, Noto FK, Nagaoka M, Li J, Battle MA, Duris C, North PE, Dalton S, Duncan SA. 2010. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51(1):297-305. https://doi.org/10.1002/hep.23354
11.
Zhang D, Jiang W, Liu M, Sui X, Yin X, Chen S, Shi Y, Deng H. 2009. Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells. Cell Res. 19(4):429-438. https://doi.org/10.1038/cr.2009.28
12.
Huang SXL, Islam MN, O'Neill J, Hu Z, Yang Y, Chen Y, Mumau M, Green MD, Vunjak-Novakovic G, Bhattacharya J, et al. 2014. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32(1):84-91. https://doi.org/10.1038/nbt.2754
Kapcsolódó cikkek
Kapcsolódó termékkategóriák
A folytatáshoz jelentkezzen be

Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.

Még nem rendelkezik fiókkal?