Gyenge sejtnövekedés hibaelhárítás
- Cell Growth:
- A sejtnövekedés értékelése <.a href="#common">A gyenge sejtnövekedés gyakori okai és megoldásai
- Általános tippek és technikák a sejtnövekedési problémák megelőzésére és kiküszöbölésére
- Videókiemelések
- Kapcsolódó termékek
Cell Growth:
A megfelelő sejtnövekedés biztosítása a sejtkultúrákkal történő pontos adatgyűjtés kritikus része. A sejteket szuszpenzióban vagy monorétegként lehet tenyészteni, amely kultúraeszközök, mint például egy lombik, tányér vagy multiwell lemez. A tenyésztési módszert a sejtek endogén fenotípusa és származási szövete határozza meg - így a vérből származó sejtek általában szuszpenzióban, míg a szilárd szövetekből származó sejtek jellemzően monolayerben nőnek. Lehetőség van olyan kevert populáció együttes tenyésztésére is, amely mind a kötött sejteket, mind a szuszpenzióban lévő fenotípusokat tartalmazza.
1. ábra.A sejtnövekedés fázisai
A monorétegként növekvő sejtek esetében a konfluencia a tenyésztőedény felületének azon százalékos aránya, amelyet mikroszkópos megfigyeléskor a sejtek rétege borít. Például az 50%-os konfluencia azt jelenti, hogy a tenyésztőedény, lombik stb. felületének felét sejtek borítják. Szuszpenziós sejtek esetében a növekedés előrehaladását általában a vonalra vagy típusra ajánlott sejtsűrűséggel mérik, de a "konfluencia" értékelhető a növekvő zavarosság és a stabil tápfolyadék színe alapján is.
A sejtek növekedése a tenyészetben általában négy fázisban történik, amelyek a sejtek számának logaritmusaként ábrázolva egy szigmoidális (S-alakú) görbét eredményeznek, bár az egyes fázisokban eltöltött idő mennyisége az egyes sejtvonalak és tenyészetek között eltérő.
Lag fázis - A sejtek akklimatizálódnak a tenyésztési körülményekhez, és ebben a fázisban nem osztódnak. A sejtek rögzülése általában a tenyésztés megkezdését követő 24 órán belül bekövetkezik. E fázis teljes hosszát a tenyésztés indításához használt sejtek növekedési fázisa és vetési sűrűsége határozza meg.
Log (logaritmikus) növekedési fázis - A sejtek ebben a fázisban aktívan osztódnak, és ez a legjobb időpont a populáció növekedésének értékelésére, valamint az általános adatgyűjtésre. A log-fázis vége a legjobb időpont a sejtek passziválására (szubkultúrázására), mielőtt a túlzsúfoltság sejtstresszhez vezethet.
Plató (stacionárius) fázis - A sejtek növekedése ebben a fázisban lelassul, ahogy a sejtek közelednek a 100%-os összefolyáshoz, és a sejtek kevesebb mint egytizede van aktív sejtciklusban. A sejtek ebben a fázisban a legérzékenyebbek a sérülésre; ezért gondos megfigyelésre van szükség annak biztosítására, hogy a sejtek passzázsra kerüljenek e fázis előtt vagy kezdetén.
Hanyatlási fázis - A sejtciklus természetes részeként az élő sejtek populációja csökken, mivel ebben a fázisban a sejthalál dominál.
A pontos sejtszámlálás kiemelkedő fontosságú a sejtnövekedés kultúrákban történő értékelésénél, mivel a hibás számlálás téves következtetésekhez vezethet a sejtek egészségére vonatkozóan. A sejtszám hemocitométerrel határozható meg. Azonban, automata sejtszámlálók amelyek a Coulter-elvet használják, ahol a sejtek egyenként áramlanak át egy elektromos érzékelőn lévő nyíláson, és a legpontosabb sejtszámlálást eredményezik.
2. ábra.Scepter™ 3.0 kézi automata sejtszámláló.
Általános tippek és technikák a sejtnövekedési problémák megelőzésére és kiküszöbölésére
A mikrobiális és kémiai szennyeződés megelőzésére szolgáló helyes sterilitási gyakorlat betartása mellett a sejtnövekedési problémák korai diagnózisának és kezelésének kulcsa a kultúrák gyakori megfigyelése és a részletes nyilvántartás vezetése. Azt is fontos mérlegelni, hogy a leghatékonyabb megoldás-e a gyenge sejtnövekedés okozójának (okozóinak) részletes és időigényes felkutatása, vagy jobb, ha egyszerűen újrakezdjük az egészet új reagensekkel, készletekkel és készletekkel.
Vigyázz óvatosan
A sejtnövekedési probléma megoldásához először is fel kell ismernünk, hogy probléma van. Sok növekedési probléma finom, ezért nem csak néhány, hanem az összes tenyésztőedény rendszeres, részletes megfigyelésére van szükség a kísérletben. A mikroszkóp alatti gyors értékelés nem biztos, hogy elegendő; a növekedés sok specifikus mintázata nem lesz nyilvánvaló, amíg a sejteket nem rögzítik és nem festik meg. Rendszeresen vizsgálja meg a táptalajt és más reagenseket a szennyeződések keresése érdekében.
Pontos feljegyzések
A rossz sejtnövekedés diagnosztizálásakor és hibaelhárításakor a tenyészet minden aspektusáról készült jó feljegyzésekkel időt és pénzt takaríthat meg, és egyedülállóan módosított sejteket, például knockout vonalakat takaríthat meg. Például a sejtsűrűség normalizálása és a törzssejtek passzázsszámának feljegyzése létfontosságú ahhoz, hogy tudjuk, hogy valószínűleg a törzssejtek jelentik-e a probléma forrását. Hasonlóképpen, mielőtt arra a következtetésre jutnánk, hogy egy adott tétel táptalaj a hibás, először meg kell bizonyosodnunk arról, hogy melyik tenyésztőcsészék kapták azt a tételt.
A feljegyzendő fontos információk közé tartozik a forrás, az azonosság és a szennyeződés hiányának igazolása, a passzázsszám, a sejtsűrűség, valamint a fagyasztási és tárolási protokollok minden törzsfiolára vonatkozóan. Az összes felhasznált reagens összetevőit (és koncentrációit), tételszámát és az első felbontás/felhasználás dátumát is fel kell jegyezni. Az összes tenyésztőedény tételszámát is fel kell jegyezni. A sejttenyésztés minden aspektusára vonatkozó részletes protokollokat kell szabványosítani és követni. Alapvető fontosságú az összes törzsfiola és tenyésztőedény pontos és részletes címkézése. Figyeljen az olyan apró részletekre, mint például az inkubátorok tisztítása és karbantartása, a CO2-tartályok cseréje, a tenyésztőhelyiség legutóbbi mikoplazma-szűrése, és jegyezzen fel minden szokatlan dolgot.
Tudja, hogy mikor vágjon vissza
Néha a probléma pontos forrásának megtalálása nem annyira fontos, mint a probléma megoldása, ezért költség- és időhatékonyabb lehet egyszerre több lehetséges okot is kijavítani a gyenge növekedés miatt, mint megpróbálni a pontos probléma elkülönítését. Például, érdemes lehet újból kezdeni egy új sejtkészletet tartalmazó fiolával és minden új táptalajjal, szérummal, pufferrel stb., minthogy az egyes tételeket egymástól függetlenül kipróbáljuk, amíg a bűnös okot fel nem fedezzük.
Kiemelt információk
Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.
Még nem rendelkezik fiókkal?