Fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH)

Reagensek és felszerelések

1. 20x sóoldat-nátrium-citrát puffer (SSC: 3 M NaCl, 0.3 M nátrium-citrát, pH 7, vagy S6639)
2. RNáz A (R4642). 100 µg/ml 2x SSC-ben
3. Pepszin (termékszám  P6887) 40 egység/ml 10 mM HCl-ben
4. Paraformaldehid, EM minőségű (termékszáma: No. P6148) frissen depolimerizált, 4% w/v vízben
5. Ethanol
6. Márkázott szonda. A plazmid DNS-t biotin-11-dUTP-vel jelöljük nick-transzlációs random priming vagy a A3803 (e.g., ADVANCE™ Nick Translation Kit)
7. Hibridizációs keverékoldat: 50% formamid (termékszám  F7508), 10% dextránsulfát (termékszám  D8906), 0,1% SDS (termékszám  D8906), 0,1% SDS (termékszám. L4390), 0,5-1,5 ng/µl jelölt szonda és 300 ng/µl lazac spermium DNS (termékszáma. D7656) 2x SSC-ben
8. Mosási puffer:  F7508) 0,1x SSC-ben
9. Detektálási puffer:  P1379) 4x SSC-ben
10. Blokkoló puffer:  A3803) a detektálási pufferben
11. Antitest vagy detektáló vegyület (pl.: A3803/A3803) a detektálási pufferben
, Streptavidin-Cy3, termékszám  S6402) blokkoló pufferben
12. DAPI (termékszám  D9542) 2 µg/ml fénytelenítő szerelőközegben.
13. Fluoreszcens mikroszkóp, szűrők és opcionális hármas sávszűrő (x58, Omega Optics)
14. Olasz tárgylemezek (termékszáma: No. S8400)
15. Műanyag fedőlemezek az inkubációs és hibridizációs lépésekhez (autoklávozható hulladékzsákokból vágva, pl,  B4408)
16. Hőblokk/módosított termocikcler
17. Koplinüvegek a mosási lépésekhez (terméksz. S6016, S5641 vagy S5891)

.

Eljárás

Dia előkészítése
Hybridizáció
Detection

Dia előkészítés

1. Kezdje bármely sejttípusból származó kromoszóma preparátummal.
2. Inkubáljuk 200 µl RNázzal 1 órán át 37 °C-on
3. Mossuk a tárgylemezeket 2x SSC-ben 5 percig. Ismételje meg.
4. Öblítse a tárgylemezeket 10 mM HCl-ben.
5. Inkubálja 200 µl pepszinnel 10 percig 37 °C-on.
6. Öblítse át a tárgylemezeket ionmentesített H₂O-ban.
7. Mossa a tárgylemezeket 2x SSC-ben 5 percig. Ismételje meg.
8. Szabilizálja a tárgylemezeket 10 percig paraformaldehidben.
9. Mossa a tárgylemezeket 2x SSC-ben 5 percig. Ismételje meg.
10. Dehidratálja a tárgylemezeket etanolos sorozatban: 70%, 80%, 95%; egyenként 2 perc.
11. Légszárítás.

Hibridizáció

1. Készítsen 30 µl hibridizációs oldatot tárgylemezenként. Melegítse 10 percig 70 °C-ra, majd helyezze jégre.
2. Tegyen 30 µl hibridizációs oldatot minden egyes tárgylemezre, és fedje le műanyag fedőpapírral.
3. Denaturálja a tárgylemezt 65-70 °C-on 5 percig hőblokkban.
4. Vissza kell csökkenteni a hőmérsékletet fokozatosan 37 °C-ra.
5. Hibridizáljuk 37 °C-on egy éjszakán át párakamrában.

Detection

1. Mossa le a tárgylemezeket 2x SSC-ben a fedőlemez eltávolításához.
2. Mossuk a tárgylemezeket 40 °C-os mosópufferben 5 percig. Ismételje meg.
3. Mossa a tárgylemezeket 0,1x SSC-ben 40 °C-on 5-15 percig.
4. Mossa a tárgylemezeket 2x SSC-ben 40 °C-on 5-15 percig.
5. Hűtse le a tárgylemezeket szobahőmérsékletre.
6. Kiegyenlítse a tárgylemezeket 5 percig detektálási pufferben.
7. Blokkolja 20-30 percig blokkoló pufferben.
8. Inkubálja 50 µl antitesttel vagy detektáló vegyülettel 30-60 percig (pl., 5 µg/ml Streptavidin-Cy3 blokkoló pufferben).
9. Mossuk a tárgylemezeket 2x SSC-ben 5 percig. Ismételje meg kétszer.
10. DAPI oldattal ellenfestjük 10 percig.
11. Röviden öblítsük le és rögzítsük fénytelenítésgátló szerelőközegbe.
12. Fluoreszcens mikroszkóppal elemezzük.
    

Hivatkozások

1. Heslop-Harrison J, Schwazarcher T, Anamthawat-Jónsson K, Leitch AR, Shi M. 1991. In situ hybridization with automated chromosome denaturation. Technique. 3109-15.

2. Leitch AR. 1994. In situ hybridization : a practical guide. Oxford (England): BIOS Scientific Publishers.

3. Harris N, Oparka KJ. 1994. Plant Cell Biology: A Practical Approach. Oxford (England): Oxford University Press.