Sejt-életképességi és proliferációs vizsgálatok

• DNS-szintézis proliferációs próbák
• Metabolikus proliferációs próbák
• Metabolikus proliferációs próbák
• Lumineszcens sejt-életképességi vizsgálatok
• Fluoreszcens-festék proliferációs vizsgálatok
• 3D sejtkultúra - élő/halott/teljes sejtek hármas festése
• Trypan Blue sejtszámlálás

Bevezetés

A sejtproliferáció, a sejtek életképességének és a citotoxicitás mérésére szolgáló vizsgálatokat általában a tenyészetben lévő sejtek válaszának és egészségének nyomon követésére használják különböző ingerekkel való kezelés után. A vizsgálati módszer megfelelő kiválasztása a felhasznált sejtek számától és típusától, valamint a várt eredménytől függ. A sejtproliferációra vonatkozó vizsgálatok a sejtek időbeli számát, a sejtosztódások számát, a metabolikus aktivitást vagy a DNS-szintézist követhetik nyomon. Az életképességi festékeket, például trypan-kéket vagy Calcein-AM-et használó sejtszámlálás mind a proliferáció mértékét, mind az életképes sejtek százalékos arányát meg tudja adni.

A sejtek életképességi és proliferációs vizsgálatainak áttekintése

Név	Áttekintés	Értesítési módszer	Előny	Hátrány
BrdU Assay	A BrdU beépül az újonnan szintetizált DNS-be, és anti-Brdu antitesttel kimutatható	ICC, IHC, FACS, ELISA	Cellciklus-kinetika, Egyetlen sejt felbontása	Hosszú protokoll Potenciális DNS-károsodás
EdU Assay	Hasonló a BrdU technikához, de antitestek nélküli, Click-Chemistry detektálást alkalmaz	ICC, IHC, FACS, ELISA		Kisebb toxicitású, mint a BrdU Gyorsabb protokoll Nincs DNS denaturáció	Drága reagensek
MTT Assay	Az MTT, egy sárga tetrazol, élő sejtekben lila formazánná redukálódik	Spektrofotométer	Gyors protokoll Nagy áteresztőképesség		Végpontos vizsgálat Az életképesség túlbecslése Végső szolubilizációs lépés
XTT Assay	Az aktívan lélegző sejtek az XTT-t vízben oldódó, narancssárga színű formazán termékké alakítják	Spektrofotométer	Nagy érzékenység Nagy dinamikai tartomány Vízben oldódó	Endpontos vizsgálat Az életképesség túlbecslése
WST-1 Assay	A WST-1 egy összetett sejtmechanizmus révén oldható formazánná hasad, amely elsősorban a sejtfelszínen történik.	Spektrofotométer	Nagyobb érzékenység Gyorsabb protokoll		Endpontos vizsgálat Az életképesség túlbecslése
Lumineszcens ATP Assay		Firefly luciferáz sejtalapú teszt az ATP számszerűsítésére sejtkultúrákban; a sejtek életképességének mérésére szolgál	Spektrofotométer		Spektrofotométerrel	Érzékeny Gyors Nagy áteresztőképességű	Szükséges a sejtek lízise
Ki67	A Ki-67 nukleáris fehérje ellenes antitestek a sejtek proliferációjának mérésére használhatók.	ICC, IHC, WB	In vivo alkalmazások		Nehéz a mennyiségi meghatározás Fixálást igényel
A nem fluoreszcens sejtáteresztő festék, a CFSE-t intracelluláris esterázok hasítják, és zöld fluoreszcenciát bocsát ki.	ICC, FACS	Élő sejtanalízis Hosszú kísérletek Kompatibilis a limfocitákkal	Toxicitás Zöld csatorna emisszió
Live/Dead Assays		Az életképes, az elhalt és az összes sejt egyidejű fluoreszcens festése calcein-AM (élő sejtek), propidium-jodid (PI, elhalt sejtek) és Hoechst 33342 (összes sejt) használatával.	ICC, FACS	Élő sejtek elemzése Gyors protokoll Egysejtes felbontás	Háttér autofluoreszkálás
Trypan Blue	Festékkizárási teszt: Az életképes sejtek nem veszik fel a festéket, de az elhalt sejtek átjárhatóak	Mikroszkópos vizsgálat	alacsony költség Gyors protokoll	Variabilitás Pontatlan

DNS-szintézis proliferációs próbák

BrdU sejtproliferációs próba

/h4>

A sejtek proliferációját egy radioizotóp, a [3H]-tiimidinnek a sejt DNS-be történő beépülésének nyomon követésével, majd autoradiográfiával lehet vizsgálni. Alternatívaként a timidin helyett 5-brom-2′-deoxi-uridin (BrdU-tesztek) is használható. A BrdU-t a DNS-ükbe beépítő sejtek könnyen kimutathatók egy BrdU elleni monoklonális antitest és egy enzim- vagy fluorokróm-konjugált másodlagos antitest használatával.

1. ábra. A, Proliferáló sejtek az E4 csirkeembrió szemében BrdU festéssel B, Anti-BrdU antitest validálása kamptotecin alkalmazásával. A Jurkat sejtek camptothecin sejtciklus-megállító szerrel történő kezelésével a keringő sejtek a G1/S fázisú átmenetben rekedtek.

EdU proliferációs próbák

A Baseclick EdU proliferációs próbák hatékony módszert biztosítanak a replikálódó DNS fluoreszcens kimutatására. A módosított nukleozid EdU-t élő sejtekhez adjuk, és beépül a replikálódó DNS-be. A Cu-indukált click-kémia lehetővé teszi a fluoreszcens szondák gyors kötését az EdU-hoz. Ez lehetővé teszi a proliferáló sejtek mennyiségi nyomon követését. A próbák különböző formátumokban állnak rendelkezésre mikroszkópos képalkotáshoz, áramlási citometriához, nagy áteresztőképességű szűréshez és in vivo kísérletekhez. Négy különböző fluoreszcens szonda 488, 555, 594 és 647-es csúcsgerjesztéssel áll rendelkezésre a más fluoreszcens szondákkal való multiplexálhatóság érdekében.

2. ábra. Az Edu-Click sejtproliferációs készletek aktív DNS-szintézis során EdU-t (5-etinil-2'-deoxiuridin) építenek be a DNS-be, és a mérés click-kémiai fluoreszcens detektálási módszerrel történik.

Metabolikus proliferációs próbák

A metabolikus aktivitást mérő próbák alkalmasak a proliferáció, az életképesség és a citotoxicitás elemzésére. A tetrazoliumsók redukciója, mint például a MTT, .XTT, és WST-1 színes formazánvegyületekhez, illetve a rezazurin bioredukciója csak metabolikusan aktív sejtekben történik. Az aktívan proliferáló sejtek növelik metabolikus aktivitásukat, míg a toxinoknak kitett sejtek aktivitása csökken.

MTT sejtproliferációs vizsgálatok

MTT (3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolium-bromid; tiazolil-kék) egy vízben oldódó tetrazolium só, amely fenolvöröset nem tartalmazó közegben vagy sóoldatban elkészítve sárgás oldatot ad. Az oldott MTT a tetrazoliumgyűrű dehidrogenáz enzimek általi hasításával oldhatatlan lila formazánná alakul át. Ez a vízben nem oldódó formazán izopropanollal vagy más oldószerekkel oldható, és az oldott anyag spektrofotometriásan mérhető az átalakított festék koncentrációjának függvényében mért abszorbancia segítségével.

XTT sejtproliferációs vizsgálatok

Az MTT-vel ellentétben a hasadási termék a XTT vízben oldódik, ezért nincs szükség szolubilizációs lépésre. Az XTT tetrazoliumsó egy összetett sejtmechanizmus révén hasad formazánná. Ez a bioredukció csak az életképes sejtekben történik, és a glikolízis révén történő NAD(P)H-termeléshez kapcsolódik. A képződő formazán festék mennyisége közvetlenül korrelál a kultúrában lévő metabolikusan aktív sejtek számával.

WST-1 sejtproliferációs vizsgálatok

A stabil tetrazoliumsó WST-1 elsősorban a sejtfelszínen lejátszódó komplex sejtmechanizmus révén oldható formazánná hasad. Ez a bioredukció nagymértékben függ a NAD(P)H glikolitikus termelésétől az életképes sejtekben. A képződő formazán festék mennyisége közvetlenül korrelál a kultúrában lévő metabolikusan aktív sejtek számával.

Protokoll útmutató: WST-1 Assay a sejtek életképességéhez és proliferációjához. Protokollok, GYIK és hibaelhárítás

3. ábra. Az MTT-teszt egy kolorimetriás teszt a sejtproliferáció értékelésére a metabolikus aktivitás alapján. A NAD(P)H-függő celluláris oxidoreduktáz enzimek tükrözik a jelen lévő életképes sejtek számát. Ezek az enzimek képesek az MTT 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium-bromid sárga tetrazoliumfestékét a lila színű, oldhatatlan formazánná redukálni.

 Luminescent Cell Viability Assays

Mivel az ATP a metabolikusan aktív sejtek mutatója, az életképes sejtek száma a rendelkezésre álló ATP mennyisége alapján értékelhető. A ATP Cell Viability Luciferase Assay egy rendkívül érzékeny homogén vizsgálatot kínál az ATP számszerűsítésére a sejtkultúrákban. Ez a kit a szentjánosbogár luciferázt használja a D-Luciferin oxidációjára és az ebből eredő fénytermelésre a sejtkultúrákban rendelkezésre álló ATP mennyiségének értékelésére. Az érzékeny vizsgálati eljárás során az ATP-detektáló koktélt egyetlen alkalommal kell közvetlenül a szérummal kiegészített tápfolyadékban tenyésztett sejtekhez adni. Nincs szükség sejtmosásra, tápfolyadék eltávolítására vagy többszöri pipettázásra. A kit elég érzékeny egyetlen sejt vagy 0,01 pikomol ATP kimutatásához. Az előállított jel hat nagyságrendben lineáris. Azáltal, hogy az ATP mennyiségét az életképes sejtek számával hozza összefüggésbe, a vizsgálat széleskörűen alkalmazható az életképes sejtek számának meghatározásától kezdve a sejtproliferáción át a sejtek citotoxicitásáig.

4. ábra. Biolumineszcens ATP luciferáz sejtéletképességi vizsgálat. A szentjánosbogár luciferáz ATP-t használ a D-luciferin oxidációjához és az ebből eredő fénytermeléshez, hogy értékelni lehessen a rendelkezésre álló ATP mennyiségét, amely korrelál a sejtek számával és életképességével.

Fluoreszcens festékkel végzett proliferációs vizsgálatok

CFSE jelölés

5(6)-Karboxifluoreszcein-diacetát N-szuccinimidil-észter (CFSE) népszerű választás egy sejtpopuláció által átélt osztódások számának mérésére. A sejtbe jutva a CFSE-t intracelluláris észterázok hasítják a fluoreszcens vegyület kialakulásához, és a szukcinimidil-észter csoport kovalensen reagál az intracelluláris fehérjék primer aminjaival. Az osztódáskor minden egyes leánysejt fluoreszcencia-intenzitása megfeleződik lehetővé téve a sejtosztódások számának egyszerű kimutatását áramlási citometriával. A CFSE-t széles körben használják a limfociták proliferációjának mérésére, beleértve a T-sejteket is.

Élő/holt sejtek kettős festése

Élő/holt sejtek kettős festése az életképes és az elhalt sejtek egyidejű fluoreszcens kimutatására használható. /HU/huCalcein-AM egy erősen lipofil és sejtmembrán-áteresztő festék. Bár maga a /HU/huCalcein-AM nem fluoreszkáló molekula, az életképes sejtben a /HU/huCalcein-AM-ből észteráz által előállított kalcein erős zöld fluoreszcenciát bocsát ki (λex 490 nm, λem 515 nm). A /HU/huCalcein-AM ezért csak az életképes sejteket festi meg. Ezzel szemben a sejtmagfestő festék Propidium-jód nem tud átjutni az életképes sejtmembránon. Az elhalt sejtmembrán rendezetlen területein áthaladva jut el a sejtmagba, és a DNS kettős spiráljával interkalálódva vörös fluoreszcenciát bocsát ki (λex 535 nm, λem 617 nm). Mivel mind a Calcein, mind a PI-DNS 490 nm-es fénnyel gerjeszthető, az életképes és az elhalt sejtek egyidejű megfigyelése egy egyszeri gerjesztésű fluoreszcencia-mikroszkóppal lehetséges.

5. ábra. Élő/halott sejtek kettős festése

3D sejtkultúra - élő/halott/teljes sejtek hármas festése

Az Cell Viability Imaging KitCell Viability Imaging Kit/a> egy három színű vizsgálat, amely 2D és 3D sejtkultúráknál használható az életképes sejtek (Calcein-AM), az elhalt sejtek (Propidium-jodid/PI), valamint az összes sejt (Hoechst 33342) egyidejű fluoreszcens festésére.

• Calcein-AM kalcium megkötésekor zöld színben fluoreszkál, kizárólag a metabolikusan aktív, életképes sejtekben jelen lévő észteráz aktivitásra támaszkodva.
• Propidium-jodid (PI) egy nukleáris festék, amelyet az élő sejtek membránja kizár, de az elhalt sejtek sérült membránján áthatol, és a DNS-sel interkalálódva erős vörös fluoreszcenciát bocsát ki.
• Hoechst 33342 egy alacsony citotoxicitású DNS-festék. Kéken fluoreszkál, és az összes sejt számának indikátoraként használják.

Trypan Blue sejtszámlálás

A Trypan Blue egyike a számos festéknek, amelyet az életképes sejtek számolásához használt festékkizáró eljárásokhoz ajánlanak. Ez a módszer azon az elven alapul, hogy az élő (életképes) sejtek nem veszik fel a kék festéket, míg az elhalt (nem életképes) sejtek igen. A sejtek életképessége az összes élő/összes (élő és elhalt) sejt arányának segítségével számítható ki. A festés megkönnyíti az általános sejtmorfológia láthatóvá tételét is.

MEGJEGYZÉS: A Trypan Blue nagyobb affinitással rendelkezik a szérumfehérjékhez, mint a sejtfehérjékhez. Ha a háttér túl sötét a szérum jelenléte miatt a mátrixban, a sejteket a számlálás előtt pelletálni kell, és fehérjeszuszpendálni kell fehérjeszegény tápfolyadékban vagy sóoldatban.

6. ábra. Cellszámlálás hemocitométerrel és Trypan-kékkel

Hivatkozások

1. Slater T, Sawyer B, Sträuli U. 1963. Studies on succinate-tetrazolium reductase systems. Biochimica et Biophysica Acta. 77383-393. https://doi.org/10.1016/0006-3002(63)90513-4

2. Mosmann T. 1983. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65(1-2):55-63. https://doi.org/10.1016/0022-1759(83)90303-4

3. Denizot F, Lang R. 1986. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Journal of Immunological Methods. 89(2):271-277. https://doi.org/10.1016/0022-1759(86)90368-6

4. Slater T, Sawyer B, Sträuli U. 1963. Studies on succinate-tetrazolium reductase systems. Biochimica et Biophysica Acta. 77383-393. https://doi.org/10.1016/0006-3002(63)90513-4