Fluoreszcencia élettartam mérés

Bevezetés

A fluoreszcencia élettartam (FLT) az az idő, amelyet egy fluorofór a gerjesztett állapotban tölt, mielőtt fotont bocsát ki és visszatér az alapállapotba. Az FLT a fluorofórtól függően pikoszekundumtól több száz nanoszekundumig terjedhet.

A fluorofórpopuláció élettartama az az idő, amelyet a gerjesztett molekulák számának exponenciális N/e értékre történő, N/e (36.8%) az eredeti populációhoz képest a fluoreszcencia vagy nem sugárzó folyamatok révén bekövetkező energiaveszteség révén.

A fluoreszcencia élettartama a fluorofór saját tulajdonsága. Az FLT nem függ a fluorofór koncentrációtól, a minta általi abszorpciótól, a minta vastagságától, a mérési módszertől, a fluoreszcencia intenzitásától, a fotofehérítéstől és/vagy a gerjesztés intenzitásától. Külső tényezők, például a hőmérséklet, a polaritás és a fluoreszcencia-csillapítók jelenléte befolyásolják. A fluoreszcencia-élettartam érzékeny a fluorofór szerkezetétől függő belső tényezőkre.¹

Fluorofór fluoreszcencia-élettartam meghatározásának módszerei

A fluoreszcencia-élettartam mérhető a frekvenciatartományban vagy az időtartományban.

Az időtartománybeli módszer során a mintát (küvettát, sejteket vagy szövetet) rövid fényimpulzussal világítjuk meg, majd az emissziós intenzitást az idő függvényében mérjük. Az FLT-t a lecsengési görbe meredekségéből határozzuk meg. Az élettartam-mérésekhez több fluoreszcencia-detektálási módszer áll rendelkezésre, amelyek közül az időkorrelált egyfoton-számlálás (TCSPC) egyszerű adatgyűjtést és fokozott kvantitatív fotonszámlálást tesz lehetővé.

A frekvenciatartománybeli módszer a beeső fény nagy frekvenciájú szinuszos modulációját jelenti. Ennél a módszernél az emisszió a beeső fénnyel azonos frekvencián történik, fáziskéséssel és a gerjesztő fényhez viszonyított amplitúdóváltozással (demoduláció) kísérve.

A fluoreszcencia élettartam-mérés előnyei az intenzitás alapú méréssel szemben²

1. Az élettartam-mérések nem igényelnek hullámhossz-arányos szondákat ahhoz, hogy számos analit mennyiségi meghatározását biztosítsák.
2. Az élettartam-módszer a spektrális eltolódással rendelkező szondák alkalmazásával kiterjeszti az analit koncentrációtartományának érzékenységét.
3. Az élettartam-mérések olyan analitok esetében is alkalmazhatók, amelyekre nincsenek közvetlen szondák. Ezek az analitok közé tartozik a glükóz, az antigének vagy bármely affinitás- vagy immunpróba, amely fluoreszcencia-energiaátviteli transzdukciós mechanizmuson alapul.

Alkalmazások

Fluoreszcencia élettartam vizsgálatok:

A fluoreszcencia élettartam egy robusztus paraméter, amely számos biológiai vizsgálatban használható. Lehetősége van arra, hogy helyettesítse a hagyományos mérési technikákat, például az abszorpciót, a lumineszcenciát vagy a fluoreszcencia intenzitást.³ A fluorofór fizikai-kémiai környezetének bármilyen változása a fluoreszcencia élettartam változásához vezet. Az élettartam-alapú próbák különböző mechanizmusok felhasználásával fejleszthetők ki, például egy egyszerű kötési próbával, amely két komponens (az egyik fluoreszcensen jelölt) kötődését foglalja magában, hogy az FLT változását idézze elő. Egy másik mechanizmus a quench-release típusú vizsgálat, amely egy nagy feleslegben jelen lévő, alacsony, de véges fluoreszcenciájú, kioltott fajjal dolgozik. Amint a fluoreszcens vegyület felszabadul (enzimatikus reakció vagy komplementer DNS-hez való kötődés révén), a rendszer élettartama megváltozik. Az FLT kombinálható FRET (Förster-rezonancia-energiatranszfer) vizsgálatokkal az energiatranszfer hatékonyságának mérésére.

Fluoreszcencia élettartam érzékelés:

Ez a technika a szonda élettartamának vagy bomlási idejének változásán alapul. A nanoszekundumos (ns) bomlási idők fázismodulációval mérhetők. Ezt a technikát széles körben alkalmazták pH, Ca²⁺, K⁺, glükóz és más metabolitok érzékelésére. A közelmúltban fejlemények történtek az élettartam-alapú érzékelés alkalmazása terén szövetekben és más véletlenszerű közegekben, olyan optikai szondák alkalmazásával, amelyek gerjesztési és emissziós spektruma a közeli infravörös tartományban van.^4,5

Fluoreszcencia élettartam képalkotás (FLI):

Ez a viszonylag új technika a fluoreszcencia bomlási ideje térbeli eloszlásának egyidejű meghatározását jelenti egy kép minden egyes pixelénél. Alapja az a tény, hogy a fluorofór fluoreszcencia-élettartama a molekuláris környezetétől függ, de nem a koncentrációjától. Alkalmazható a fluoreszcens mikroszkópiában, ahol a helyi szondakoncentráció nem szabályozható. A fluoreszcencia élettartam képalkotó mikroszkópiát (FLIM) a molekuláris környezet paramétereinek, a fehérje-kölcsönhatások Förster-rezonancia energiaátvitellel (FRET), és a sejtek és szövetek anyagcsereállapotának mérésére használják az autofluoreszcencián keresztül. A molekuláris környezet paraméterei a fluoreszcencia kioltása vagy a fluoroforok konformációjának változása által indukált élettartam-változásokból mérhetők. A FLIM biológiai alkalmazásokban használható, többek között a szövetfelületek letapogatásában, a szövet típusának feltérképezésében, a fotodinamikus terápiában, a DNS-chipek elemzésében, a bőr képalkotásában stb.⁶

A gyenge emitterek rövidebb fluoreszcencia-élettartammal rendelkeznek, míg a hosszabb élettartamú fluoroforok alacsony fotonforgalommal rendelkeznek. Ezek korlátozott érzékenységük, valamint a hosszú expozíciós és felvételi idő szükségessége miatt nem túl hasznosak az élettartam-képalkotásban.

Az élettartam-képalkotásban általánosan használt fluoreszcens molekulák és szondák különböző osztályait az alábbiakban soroljuk fel:

Hivatkozások

1. Berezin MY, Achilefu S. 2010. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev.. 110(5):2641-2684. https://doi.org/10.1021/cr900343z

2. Szmacinski H, Lakowicz JR. 1995. Fluorescence lifetime-based sensing and imaging. Sensors and Actuators B: Chemical. 29(1-3):16-24. https://doi.org/10.1016/0925-4005(95)01658-9

3. Doering K, Meder G, Hinnenberger M, Woelcke J, Mayr LM, Hassiepen U. 2009. A Fluorescence Lifetime-Based Assay for Protease Inhibitor Profiling on Human Kallikrein 7. J Biomol Screen. 14(1):1-9. https://doi.org/10.1177/1087057108327328

4. Lakowicz JR. 1994. Topics in Fluorescence Spectroscopy. https://doi.org/10.1007/b112911

5. Hutchinson C, Lakowicz J, Sevick-Muraca E. 1995. Fluorescence lifetime-based sensing in tissues: a computational study. Biophysical Journal. 68(4):1574-1582. https://doi.org/10.1016/s0006-3495(95)80330-9

6. Clegg RM, Holub O, Gohlke C. 2003. [22] Fluorescence lifetime-resolved imaging: Measuring lifetimes in an image.509-542. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(03)60126-6