Ficoll^® 400 gradiens centrifugáláshoz

Termékszám. F4375

CAS #: 26873-85-8

A Ficoll^® 400 egy erősen elágazó polimer, amely szacharóz és epiklórhidrin kopolimerizációjával jön létre. A Ficoll^® 400 teljesen ionmentes. A hidroxilcsoportok bősége miatt a Ficoll^® 400 nagyon hidrofil és rendkívül vízoldékony. A Ficoll^® 400 leggyakoribb alkalmazása sűrűséggradiens közegként eukarióta sejtek, organellák és baktériumsejtek elválasztására és izolálására. Akár 1,2 g/ml sűrűségtartományok is elérhetők. Számos más alkalmazásban is hasznosították.

Fizikai tulajdonságok

Megjelenés: Fehér vagy fehér színű, halvány sárga színű porral

Száradáskor elvesztése: Legfeljebb 5%¹

Molekulatömeg: 400,000 +/- 100,000 a belső viszkozitás¹

Specifikus forgás: +56.5° 20 °C-on (C=1% vízben)¹                                                         

Intrinsic viszkozitás: Viszkozitás: körülbelül 0.17 dl/g¹

Dializálható anyag, beleértve a NaCl-t: kevesebb, mint 1%¹

Stokes sugár:

A szacharóztól eltérően a Ficoll oldatok viszonylag alacsony ozmolalitással rendelkeznek. Ennek ellenére a Ficoll sűrűsége vizes oldatokban a szacharózéhoz hasonló.

A nagy molekulatömeg és a dializálható anyag alacsony tartalma miatt a Ficoll sokkal kisebb permeabilitással rendelkezik a sejtmembránok felé, mint a szacharóz. Ezért a sejtek várhatóan kisebb sűrűségben gyűlnek össze a Ficoll gradiensben, mint a szacharóz gradiensben. Az alacsony membránpermeabilitás és az alacsony ozmotikus nyomás miatt a Ficollban történő elválasztások általában a sejtfunkciók és a morfológia jobb megőrzését eredményezik.

Tárolás/Szabályozhatóság

A Ficoll 400 megfelelően, por alakban, szobahőmérsékleten tárolva várhatóan 5 évig eltartható.

Lazíthatóság/oldatstabilitás

Vízben 50%-os (w/v) koncentráció érhető el. A Ficollt lassan, folyamatos keverés mellett kell hozzáadni.

A Ficoll 400 oldhatóságát 1g 10ml deionizált vízben vizsgálva tiszta vagy enyhén zavaros, színtelen vagy halványsárga oldatot kapunk. 

A Ficoll lúgos és semleges oldatokban stabil. A 3 alatti pH-értékeknél gyorsan hidrolizálódik, különösen magas hőmérsékleten. 

A fikoll semleges pH-nál, 110 °C-on 30 percig tartó autoklávozással sterilizálható. 

Az erős oxidáló és redukáló szerek kerülendők.

Eljárás

Centrifugálás

A Ficoll^® 400 használható gradiens centrifugáláshoz minden típusú centrifuga rotorban és egységnyi gravitáció mellett történő elválasztáshoz. A centrifugáláshoz diszkontinuus és folyamatos gradiensek egyaránt lehetségesek. A diszkontinuus gradiensek két fő előnyt kínálnak: Először is, a Ficoll 400 sűrűségének hirtelen változása azt jelenti, hogy az izolált sejtek éles sávokban találhatók a különböző sűrűségű rétegek közötti határfelületen. Ez lehetővé teszi a minta könnyű eltávolítását pipettával. Másodszor, a nagy sűrűségkülönbségű sejtek már két sűrűségű réteggel is könnyen izolálhatók. Ez úgy érhető el, hogy olyan sűrűségeket választunk, amelyek megakadályozzák, hogy egy vagy több sejttípus belépjen az alacsonyabb fázisba, és ezeket a sejttípusokat a határfelületen sávokba zárjuk.

Az adott alkalmazáshoz szükséges sűrűségek becsléséhez tekintse meg az alábbi táblázatot:

forrás	Buoyant Density	Feltételek
Membránok	1.05		100 000xg 16 órán keresztül
Kromatofórák	1.07	195 000xg 36 órán keresztül
Hepatociták	1.10-1,15	6 000xg 2 órán keresztül
Fibroblasztok	1.05	8.000xg 1 órán keresztül
Ehrlich ascites sejtek	1.07	1.400xg 45 percig

1. ábra. A Ficoll sűrűségének grafikonja a koncentráció függvényében a következő.

Diszkontinuus gradiens előkészítése:

1. Készítsen Ficoll 400 pufferben vagy izotóniás szacharózoldatban (0,25 M) olyan koncentrációban, amely elválasztja a vizsgált anyagot. A legtöbb sejt és organellum felhajtó sűrűsége 1,0 és 1,2 g/ml között van a Ficoll 400-ban.  Gyakran elegendő egy kétrétegű gradiens. Az ebben a lépésben készült oldatok tárolhatók hűtőszekrényben, de szobahőmérsékleten kell felhasználni.
   
2. A szabványos centrifugacsövekben készítsen rétegeket
   (kb. 1 cm mélyen) úgy, hogy a legsűrűbb réteg legyen alul.
   
3. Vigyázva, hogy a gradiens rétegei ne keveredjenek, óvatosan rétegezze rá a mintát. Óvatosan keverje meg a mintát és a legfelső Ficoll 400 réteget egy üvegpálcával, hogy a centrifugálás előtt megszüntesse a határfelületet.

A centrifugálás során a különböző részecskék a sűrűségüktől függően vagy a Ficoll-rétegekben, vagy azok között fognak összegyűlni. A centrifugálás befejeztével pipettázza le a különböző fázisokat, és távolítsa el a Ficollt a kívánt frakciókból. A Ficoll eltávolítható az izolált sejtekből és organellákból a pufferrel történő hígítás és az azt követő centrifugálás ismételt ciklusaival. A mintában maradó Ficoll 400 mennyiségét az antronreakcióval lehet megbecsülni.²

Egyes esetekben folyamatos vagy lineáris sűrűséggradiensre lehet szükség. Ez könnyen elkészíthető gradiens keverővel. Egyszerű elválasztásokhoz egy homológ Ficoll 400 oldat is használható gradiens nélkül.  A frakcionálás a centrifugálási sebesség fokozatos növelésével történik. A Ficollt zonális centrifugálási vizsgálatokban is alkalmazták.³

A sűrűséggradiensben történő gravitációs szedimentációt széles körben használják a centrifugálásra érzékeny sejtek elválasztására. A hasonló sűrűségű, de különböző méretű sejtek is hatékonyan elválaszthatók egységnyi gravitációval.^4,5,6

Ficoll-Hypaque sűrűségű közeg (Histopaque)

A Ficoll-Hypaque-ot igénylő alkalmazásokban Ficoll és nátriumdiatrizoát keverékét alkalmazzák. Három különböző sűrűségű előre elkészített keveréket kínálunk a Histopaque-1077 terméknevek alatt., 1083, és 1119.

Nukleinsav hibridizáció

A Ficoll 400 a Northern és Southern blot analízisben használt Denhardt-oldat egyik összetevője. A Ficoll csökkenti az anyag nem specifikus kötődését a nitrocellulózmembránokhoz a nukleinsav hibridizáció során.⁷

Kínálunk egy Denhardt-oldatot (termékszám D2532), 50X koncentrátumot, amelyet nukleinsav hibridizációhoz teszteltek. A tipikus hibridizációs oldatok 5X koncentrációjú Denhardt-oldatot igényelnek.

Immunológiai alkalmazások

A Ficoll 400-at hapten-hordozóként alkalmazták, és dinitrofenollal, trinitrofenollal és fluoreszceinizotiocianáttal konjugálták egerekben az elsődleges immunválasz fokozása céljából. A különböző szubsztitúciós szintekkel és minimális toxicitással rendelkező konjugátumok könnyen előállíthatók.^8,9

Kémiailag meghatározott sejttenyésztő közegek

A Ficoll szérumból származó növekedési faktorokkal és anélkül is használható mind az elsődleges kultúrák, mind a létrehozott sejtvonalak növekedésének támogatására.^10,11

Koncentrációs dialízis

A Ficoll 400 hasznos az oldatok dialízissel történő koncentrálásához, mivel nagy molekulatömege megakadályozza, hogy áthatoljon a dialízismembránon. Az ozmotikus nyomás a vizet a membránon keresztül a Ficoll 400 oldatába vonzza, így hatékonyan koncentrálja az érzékeny anyagokat.¹

Elektroforézis

A folyamatos áramlású elektroforézishez általában stabilizátorra van szükség az elektrolitban. Erre az alkalmazásra gyakran használják a Ficoll 400-at.^12,13

Fázisfelosztás

A fázisfelosztás a felszíni tulajdonságok alapján választja el a sejteket. A Ficoll 400-at kétfázisú rendszerekben polietilénglikollal, háromfázisú rendszerekben pedig dextrannal és polietilénglikollal kombinálják.^14,15

Fiziológiai perfúziós és sejtstabilizáló oldatok

A Ficollt a fiziológiás sóoldatos perfuzátumhoz adták az erek fehérje-kiválasztásának megfigyelése során. A vitrifikált egérembriókat 30% Ficollt és 0,5 M szacharózt tartalmazó oldatokkal hígítottuk.¹⁷ Isolált patkányvese perfúziója 4,7% Ficoll 400-t tartalmazó Tyrode-oldattal történt.¹⁸

*A Ficoll a Pharmacia bejegyzett védjegye. A fizikai tulajdonságokra és alkalmazásokra vonatkozó információkat a Pharmaciától szereztük be.

Hivatkozások

1. Supplier Data.

2. Scott TA, Melvin EH. 1953. Determination of Dextran with Anthrone. Anal. Chem.. 25(11):1656-1661. https://doi.org/10.1021/ac60083a023

3. Lavrenko PN, Mikriukova OI, Okatova OV. 1987. On the separation ability of various ficoll gradient solutions in zonal centrifugation. Analytical Biochemistry. 166(2):287-297. https://doi.org/10.1016/0003-2697(87)90577-x

4. Tulp A, Bont W. 1975. An improved method for the separation of cells by sedimentation at unit gravity. Analytical Biochemistry. 67(1):11-21. https://doi.org/10.1016/0003-2697(75)90267-5

5. Bont WS, De Vries JE, Geel M, Van Dongen A, Loos HA. 1979. Separation of human lymphocytes and monocytes by velocity sedimentation at unit gravity. Journal of Immunological Methods. 29(1):1-16. https://doi.org/10.1016/0022-1759(79)90120-0

6. Niskanen E, Wells JR, Golde DW, Cline MJ. 1985. Separation By Velocity Sedimentation of Human Haemopoietic Precursors Forming Colonies in vivo and in vitro Cultures. Cell Prolif. 18(4):399-406. https://doi.org/10.1111/j.1365-2184.1985.tb00670.x

7. Sambrook J. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. p. 9.48 - 50, B.15. Cold Spring Harbor Laboratory.

8. McMaster PR, Owens JD, Vannier WE. 1977. The preparation and characterization of a thymic independent antigen: ?-dinitrophenyl-L-lysine-ficoll. Immunochemistry. 14(3):189-196. https://doi.org/10.1016/0019-2791(77)90193-8

9. Inman JK. 1975. Thymus-independent antigens: the preparation of covalent, hapten-ficoll conjugates. J. Immunol. 114704.

10. Clark J, Fisher G, Wieser RJ. 1983. Hormonally Defined Media, Lecture Posters, Eur. Conf. Serum-Free Cell Culture. Berlin: Springer.

11. Kao K. 1981. Plant Formation from Barley Anther Cultures with Ficoll Media. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 103(5):437-443. https://doi.org/10.1016/s0044-328x(81)80166-3

12. Platsoucas CD, Catsimpoolas N. 1980. Density gradient electrophoresis of mouse spleen lymphocytes: Age-related differences. A critical thymus-dependent event during development in the young adult mouse. Journal of Immunological Methods. 34(1):31-41. https://doi.org/10.1016/0022-1759(80)90221-5

13. Platsoucas CD, Good RA, Gupta S. 1980. Separation of human lymphocyte subpopulations by density gradient electrophoresis. Cellular Immunology. 51(2):238-249. https://doi.org/10.1016/0008-8749(80)90256-7

14. Johansson G, Joelsson M. 1991. Partition of hydrophobic compounds between two liquid phases of similar hydrophobicity. Journal of Chromatography A. 46449-59. https://doi.org/10.1016/s0021-9673(00)94222-5

15. Albertsson P, Birkenmeier G. 1988. Affinity separation of proteins in aqueous three-phase systems. Analytical Biochemistry. 175(1):154-161. https://doi.org/10.1016/0003-2697(88)90373-9

16. Nolly H, Nolly A. 1998. Release of endothelial-derived kallikrein, kininogen and kinins. Biol. Res. 31(3)169-174.

17. Mukaida T, Wada S, Takahashi K, Pedro P, An T, Kasai M. 1998. Vitrification of human embryos based on the assessment of suitable conditions for 8-cell mouse embryos. Human Reproduction. 13(10):2874-2879. https://doi.org/10.1093/humrep/13.10.2874

18. Barthelmebs M, Loichot C, Nisato D, de Jong W, Grima M, Imbs JL. 1998. [Modulation by nitric oxide of vasopressin induced renal vasoconstriction varies with perfusate viscosity in the isolated rat kidney]. Arch. Mal. Coeur. Vaiss. 91(8):

19. Hong YH, Moon Y, Jeong DK, Han JY. 1998. Improved Transfection Efficiency of Chicken Gonadal Primordial Germ Cells for the Production of Transgenic Poultry. Transgenic Res.(7):247–252.

20. Atawodi SE, Lea S, Nyberg F, Mukeria A, Constantinescu V, Ahrens W, Brueske-Hohlfeld I, Fortes C, Boffetta P, Friesen MD. 1998. 4-Hydroxy-1-(3-pyridyl)-1-butanone-hemoglobin adducts as biomarkers of exposure to tobacco smoke: validation of a method to be used in multicenter studies. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 7817.

21. Oosterwijk JC. 1998. Prenatal diagnosis of trisomy 13 on fetal cells obtained from maternal blood after minor enrichment. Prenat. Diagn. 181082.

22. Krackhardt A. 1989. Exp. Hematol. 261265.

23. Woods JA, Evans JK, Wolters BW, Ceddia MA, McAuley E. 1998. Effects of Maximal Exercise on Natural Killer (NK) Cell Cytotoxicity and Responsiveness to Interferon-  in the Young and Old. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 53A(6):B430-B437. https://doi.org/10.1093/gerona/53a.6.b430

24. Schlenke P, Klu?ter H, Mu?ller-Steinhardt M, Hammers H, Borchert K, Bein G. 1998. Evaluation of a Novel Mononuclear Cell Isolation Procedure for Serological HLA Typing. Clin. Diagn. Lab. Immunol.. 5(6):808-813. https://doi.org/10.1128/cdli.5.6.808-813.1998

25. Hull DR, Corr BR, Markey GM, Alexander HD, Morris TC. 1998. Familiality of monocyte esterase deficiency in patients on continuous ambulatory peritoneal dialysis. Renal Failure. 20(4):607-612. https://doi.org/10.3109/08860229809045153

26. Krieger K, Klimke A, Henning U. 1998. Active [3H]-Dopamine Uptake Displayed by Native Lymphocyte Suspensions is Mainly Due to Contaminating Platelets. Pharmacopsychiatry. 31(05):193-198. https://doi.org/10.1055/s-2007-979326

27. Brandhorst H, Brandhorst D, Brendel MD, Hering BJ, Bretzel RG. 1998. Assessment of Intracellular Insulin Content during All Steps of Human Islet Isolation Procedure. Cell Transplant. 7(5):489-495. https://doi.org/10.1177/096368979800700508

28. Lakey JR, Cavanagh TJ, Zieger MA. 1998. A Prospective Comparison of Discontinuous Euroficoll and Eurodextran Gradients for Islet Purification. Cell Transplant. 7(5):479-487. https://doi.org/10.1177/096368979800700507

29. Vida TA, Graham TR, Emr SD. 1990. In vitro reconstitution of intercompartmental protein transport to the yeast vacuole.. 111(6):2871-2884. https://doi.org/10.1083/jcb.111.6.2871

30. Yemul S, Berger C, Estabrook A, Suarez S, Edelson R, Bayley H. 1987. Selective killing of T lymphocytes by phototoxic liposomes.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84(1):246-250. https://doi.org/10.1073/pnas.84.1.246

31. Schneider E, Lepault F, Guy-Grand D, Minkowski M, Dy M, Immunol J. 1987. Histamine-producing cell-stimulating activity. Interleukin 3 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor induce de novo synthesis of histidine decarboxylase in hemopoietic progenitor cells. 1393710.

32. Volloch V, Schweitzer B, Rits S. 1987. Synthesis of globin RNA in enucleated differentiating murine erythroleukemia cells.. 105(1):137-143. https://doi.org/10.1083/jcb.105.1.137