Humán mesenchymális őssejtek és növekedési médiumok

Ezek a termékek az Egyesült Államokban, Kanadában és egyes európai országokban kaphatók.

• Primary Human Mesenchymal Stem Cell Culture System
• .Protokollok a humán mesenchymális őssejtek tenyésztéséhez
• Humán mesenchymális őssejt tenyésztési rendszer minőségellenőrzése
• <.a href="#anyag">Anyagok a humán mesenchymasejtek tenyésztéséhez

Primer humán mesenchymális őssejt tenyésztési rendszer

A mesenchymális őssejtek (MSC), más néven mesenchymális sztromális sejtek, önmegújuló multipotens sejtek, amelyek képesek különböző sejttípusokká differenciálódni. Az MSC-kről kimutatták, hogy in vitro adipocitákká, chondrocitákká, osteoblastokká, myocitákká és ß-pankreász szigetsejtekké differenciálódnak. Az MSC transzdifferenciálódhat neuronális sejtekké és hepatocitákká is.

A PromoCell^® Mesenchymalis őssejteket különböző eredetű normál emberi szövetekből, többek között csontvelőből, köldökzsinórmátrixból és zsírszövetből állítják elő. Az MSC differenciálása adipocitákká, oszteoblasztokká, kondrocitákká és neuronális vonalakká végezhető a Mesenchymal Stem Cell Differentiation Media használatával. Röviddel az izolálás után minden mesenchymális őssejtet kriokonzerválunk a szabadalmaztatott, szérummentes fagyasztóközeg, Cryo-SFM használatával. A sejtek felolvasztása és beültetése a 2. passziót (P2) jelenti. Minden egyes kriovial legalább 500 000 életképes sejtet tartalmaz felolvasztáskor. A humán mesenchymális őssejtek három napig felolvasztott és tenyésztett, kriokonzervált sejtekből létrehozott, proliferáló sejtkultúrák formájában is rendelkezésre állnak.

A Mesenchymal Stem Cell Media-t a csontvelőből, a köldökzsinórmátrixból (Wharton´s Jelly) vagy a zsírszövetből izolált mesenchymalis őssejtek (MSC) expanziójára és irányított differenciálására fejlesztették ki.  A Mesenchymal Stem Cell Media médiumként (felhasználásra kész) kapható, és egy üveg Basal Mediumból és egy fiola SupplementMixből áll.  A SupplementMix hozzáadása az Basal Mediumhoz alkotja a teljes médiumot.

MSC Expansion Media	MSC differenciáló médiumok
Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2 (optimalizált, alacsony szérumtartalmú készítmény) Mesenchymal Stem Cell Growth Medium DXF (meghatározott, xeno-mentes készítmény, amelyhez fibronectinnel bevont edényekre van szükség)	Mesenchymal Stem Cell Adipogenic Differentiation Medium 2 Mesenchymal Stem Cell Osteogenic Differentiation Medium Mesenchymal Stem Cell Osteogenic Differentiation Medium Mesenchymalis őssejtek kondrogén differenciálódási médiuma Mesenchymalis őssejtek kondrogén differenciálódási médiuma induktorok nélkül Mesenchymalis őssejtek neurogén differenciálódási médiuma

Mesenchymal Stem Cell Media kiegészítés részletei

A Mesenchymal Stem Cell Media tartalmazza az összes olyan növekedési faktort és kiegészítőt, amely a humán mesenchymal őssejtek optimális terjeszkedéséhez és irányított differenciálódásához szükséges. A Mesenchymal Stem Cell Growth Medium DXF, az MSC Chondrogenic Differentiation Medium, az MSC Chondrogenic Differentiation Medium w/o Inducers és az MSC Neurogenic Differentiation Medium mind definiált és szérummentes.  A Mesenchymal Stem Cell Media nem tartalmaz antibiotikumokat vagy antimikotikumokat, és 5% CO₂ atmoszférájú inkubátorban történő használatra készült.

Megjegyzés: Az MSC Chondrogenic Differentiation Medium w/o Inducers (MSC kondrogén differenciáló médium induktorok nélkül) terméket a felhasználónak megfelelő kondrogén induktorokkal kell kiegészítenie.

Kultúraedény felületi bevonata MSC-kultúrához

A DXF MSC Growth Medium nem tartalmaz kötődési és terjedési faktorokat. Ezért az MSC Growth Medium DXF-fel használt tenyésztőedényeket a gyártó protokolljának megfelelően 10 μg/mL humán fibronectinnel kell előzetesen bevonni.  Alternatívaként szarvasmarha-fibronectin is használható.

Kiegészítő médiumok előkészítése MSC-kultúrához

• A SupplementMixet 37°C-os víz- vagy termálfürdőben, időnkénti kavargatással olvassa fel. Fontos megjegyzés: Ne inkubálja tovább a szükségesnél. Amennyiben a teljes felolvasztás után látható csapadékok keletkeznek, óvatosan keverje, amíg minden csapadék újra fel nem oldódik.
• Az egyes kiegészítők teljes tartalmát vigye át a Basal Mediumba.
• Zárja le a palackot és óvatosan keverje, amíg homogén keverék nem keletkezik.

Az MSC termékek tárolása és stabilitása

• A megérkezést követően azonnal tárolja a Basal Mediumot 4-8°C-on, sötétben; ne fagyassza le a Basal Mediumot. A SupplementMixet -20°C-on tárolja.
• Az előírásoknak megfelelően történő tárolás esetén a termékek a megadott lejárati dátumig stabilak.
• Amikor a kiegészítőket hozzáadjuk a Basal Mediumhoz, a teljes médium eltarthatósági ideje 4 - 8°C-on hat hét. Ne fagyassza le a teljes táptalajt.
• A felhasználáshoz a teljes táptalajból csak az egyszeri felhasználáshoz szükséges mennyiséget aliquotálja és melegítse elő, a fennmaradó táptalajt pedig tartsa hűtve 4 - 8°C-on.
• A kriokonzervált MSC-ket a szállítás után közvetlenül kell beültetni, vagy azonnal folyékony nitrogénben kell tárolni.
• A burjánzó MSC-ket azonnal fel kell dolgozni.

A humán mesenchymális őssejtek tenyésztésének protokolljai<

Protokoll a kriokonzervált mesenchymális őssejtek kezeléséhez

Fontos megjegyzések:

• A kriokonzervált sejteket megérkezésük után azonnal tárolja folyékony nitrogénben, vagy azonnal vesse be őket. A -80°C-on történő tárolás nem elegendő a sejtek megőrzéséhez, és visszafordíthatatlan sejtkárosodást okoz.
• Aszeptikus technikák alkalmazásával és lamináris áramlású biológiai biztonsági szekrényben kezelje
• Fibronectin bevonatú tenyésztőedények szükségesek az MSC Growth Medium DXF használatával (lásd a Medium előkészítés 1b lépés).

1. Készítse elő a táptalajt
   
   a.) Az MSC Growth Medium 2 esetében
   
   
   Számítsa ki a szükséges tenyésztési felületet az ajánlott tenyésztési sűrűség (lásd az alábbi táblázatot) és az analitikai tanúsítványon feltüntetett tétel-specifikus sejtszámok alapján. Töltse a megfelelő mennyiségű PromoCell® Growth Mediummal (legalább 9 ml sejtek injekciós üvegenként) sejttenyésztő edényekbe. Helyezze az edényeket 30 percre inkubátorba (37°C, 5% CO₂).
   
   b.) MSC Growth Medium DXF
   
   
   Számítsa ki a szükséges tenyésztési felületet az ajánlott tenyésztési sűrűségnek (lásd az alábbi táblázatot) és az analitikai tanúsítványon feltüntetett tétel-specifikus sejtszámoknak megfelelően. A tenyésztőedényeket 10 µg/cm² humán vagy szarvasmarha fibronectinnel vonja be a gyártó utasításai szerint. Töltse meg az előzetesen bevont edényeket a megfelelő mennyiségű PromoCell Growth Mediummal (legalább 9 ml sejtes injekciós üvegenként). Helyezze az edényeket 30 percre inkubátorba (37°C, 5% CO₂).
   
   
2. A sejtek felolvasztása
   Vegye ki a kriovialitást a folyékony nitrogén tartályból, és azonnal helyezze szárazjégre - akár rövid szállításhoz is. Lamináris áramlású biológiai biztonsági szekrény alatt rövid időre csavarja el a kupakot egy negyed fordulatot a nyomás enyhítése érdekében, majd húzza vissza. Merítse az injekciós üveget vízfürdőbe (37 °C), egészen a csavaros kupakig 2 percre. Ügyeljen arra, hogy a csavaros kupak menetébe ne jusson víz.
   
   
3. A fiola fertőtlenítése és a sejtek beültetése
   Lamináris áramlású biológiai biztonsági szekrény alatt alaposan öblítse át a kriofiolát 70%-os etanollal. Ezután szívja le a felesleges etanolt a csavaros kupak menetes területéről. Nyissa ki a fiolát, és helyezze át a sejteket egy sejttenyésztő edénybe, amely az 1. lépésből származó előmelegített tápfolyadékot tartalmazza.
    
4. Inkubálja a sejteket
   Helyezze az edényt inkubátorba (37°C, 5% CO₂) a sejtek rögzítéséhez. Cserélje ki a táptalajt 3-4 óra elteltével, majd ezt követően két-három naponta. A sejteket a szubkultiválási protokoll szerint (lásd alább) szubkultiválni kell, amint elérték a 70-90%-os konfluenciát.

Protokoll a proliferáló humán mesenchymális őssejtek kezeléséhez

Fontos megjegyzések:

• A sejtek szállítása után azonnal kezdje el.
• Aszeptikus technikákat és lamináris áramlású biológiai biztonsági szekrényt használjon.
• Az MSC Growth Medium DXF neveléshez fibronectin bevonatú műanyag edényekre van szükség (lásd a kriokonzervált sejtek protokollja, 1b lépés).

1. Inkubáljuk a sejteket
   Csomagoljuk ki a tenyésztőedényt, ne nyissuk ki a kupakot, és azonnal helyezzük inkubátorba (37°C, 5% CO₂) 3 órára, hogy a sejtek regenerálódjanak a szállításból.
   
   
2. Töltse vissza a szállítóközeget
   Óvatosan nyissa ki az edényt, öblítse le a fedél belső oldalát 70%-os etanollal, és hagyja levegőn megszáradni. Szívja ki a szállítóközeget (Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2) az edényből. Adjon hozzá 10 ml megfelelő PromoCell^® sejtnövesztő médiumot.
   
   
3. A sejtek ellenőrzése és inkubálása
   Ellenőrizze a sejtsűrűséget. Nyissa ki a kupakot egy fél fordulatra a szellőztetéshez, vagy használjon szellőzős kupakkal ellátott lombikokat, és helyezze az edényt inkubátorba (37°C, 5% CO₂). Két-három naponta cserélje a tápfolyadékot. A sejteket az alábbi szubkultiválási protokoll szerint kell szubkultiválni, amint elérték a >70%-os konfluenciát.

Subkultiválási protokoll a mesenchymális őssejtekhez

Fontos megjegyzések:

• A DXF MSC Growth Mediummal történő tenyésztéshez fibronectinnel bevont tenyésztőedényekre van szükség (lásd a kriokonzervált sejtek protokollját, 1b lépés).
• A humán MSC rutinszerű szubkultúrájához az Accutase^® disszociációs reagens használata erősen ajánlott minden MSC növekedési médiummal együtt.
• Aszeptikus technikákat és lamináris áramlású biológiai biztonsági szekrényt használjon.

1. Készítse elő a reagenseket és mossa a sejteket
   Az Accutase^® oldatot legalább 30 percre szobahőmérsékletre kell helyezni, hogy a reagensek hőmérséklete beálljon. Óvatosan szívja le a tápfolyadékot a tenyésztőedényből. Adjon 100 µl HEPES BSS oldatot cm² edényfelületenként a sejtek kimosásához, és óvatosan keverje az edényt 15 másodpercig.
   
   
2. Vegye ki a sejteket
   Óvatosan szívja ki a HEPES BSS puffert a tenyésztőedényből. Adjon hozzá 100 µl Accutase oldatot az edény felületének cm² -enként, és inkubálja 2-4 percig szobahőmérsékleten. Zárja le az edényt, és vizsgálja meg a sejteket mikroszkóp alatt. Amikor a sejtek elkezdenek leválni, óvatosan kopogtassa meg az edény oldalát a maradék sejtek fellazításához.
   
   
   
3. A sejtek betakarítása
   Óvatosan szívja le a sejtszuszpenziót, és helyezze át egy centrifugálócsőbe. Pörgesse a sejteket 3 percig 220 x g-n.
   
   
   
4. Inkubálja a sejteket
   Dobja el a felülúszót, adjon hozzá 1 ml megfelelő sejtnövesztő médiumot, és óvatos fel-le pipettázással szuszpendálja újra a sejteket. Ültesse a sejteket az ajánlott vetési sűrűségnek megfelelően új steril sejttenyésztő edényekbe, amelyek előmelegített sejtnövesztő médiumot tartalmaznak. Helyezze az edényeket inkubátorba (37°C, 5% CO₂), és két-háromnaponta cserélje a táptalajt.

Humán mesenchymális őssejt tenyésztési rendszer minőségellenőrzés

Humán mesenchymális őssejtek minőségellenőrzése

Minden egyes humán mesenchymális őssejt tételen szigorú minőségellenőrzési vizsgálatokat végzünk.

• Vizsgálják a sejtmorfológiát, a proliferációs potenciált, a tapadási arányt és a sejtek életképességét.
• A markerek átfogó panelének áramlási citometriai elemzésével jellemezzük, beleértve a CD73/CD90/CD105 és CD14/CD19/CD34/CD45/HLA-DR markereket, az ISCT [1] javaslatának megfelelően.
• Az adipogén, oszteogén és kondrogén vonalba történő differenciálódási vizsgálatokat minden egyes tétel esetében antibiotikumok és antimikotikumok nélküli tenyésztési körülmények között végezzük.
• Vizsgálják a HIV-1, HIV-2, HBV, HCV, HTLV-1, HTLV-2 és mikrobiális szennyeződések (gombák, baktériumok és mikoplazma) hiányát.
• A részletes analitikai tanúsítvány (CoA) minden tételről letölthető.

Humán mesenchymális őssejtek specifikációi

Termék	Javasolt táptalajok	Javasolt differenciáló táptalajok	Plating Density
Humán mesenchymális őssejtek csontvelőből (hMSC-BM)	C-28009 C-28019	C-28016 C-28012 C-28013 C-28014 C-28015	4000 sejt per cm²
Humán mesenchymális őssejtek köldökzsinórmátrixból (hMSC-UC)	C-28009		C-28009 br> C-28019	C-28016 C-28012 C-28013 C-28014 C-28015	4,000 sejt per cm²
Humán mesenchymális őssejtek zsírszövetből (hMSC-AT)	C-28009 C-28019	C-28016 C-28012 C-28013 C-28014 C-28015	4000 sejt per cm²

Mesenchymal Stem Cell Media minőségellenőrzés

A PromoCell^® Mesenchymal Stem Cell Media minden tételét átfogó minőségellenőrzési teszteknek vetjük alá primer humán mesenchymal őssejtek felhasználásával. Minden egyes MSC Growth Medium tétel validálva van a vizsgált mesenchymális őssejtek multipotenciájának, növekedést elősegítő aktivitásának, adhéziós arányának és tipikus morfológiájának fenntartása szempontjából. Az MSC differenciáló médiumok minden egyes tételét tesztelik az MSC-k specifikus sejtvonalakba történő irányított differenciálódásának indukálására való képesség szempontjából. Ezen túlmenően minden tétel táptalajt teszteltünk mikrobiális szennyeződések (gombák, baktériumok, mikoplazma) hiánya szempontjából.

A Mesenchymal Stem Cells and Media System rendeltetésszerű használata

Ezek a termékek kizárólag in vitro felhasználásra, nem diagnosztikai vagy terápiás eljárásokra szolgálnak. A biztonsági óvintézkedéseket lásd a megfelelő biztonsági adatlapon.