ADCC vizsgálat BioIVT kriokonzervált NK sejtek felhasználásával

• Antibody-dependent Cellular Cytotoxicity (ADCC)
• ADCC protokoll
• ADCC Assays Using Cryopreserved NK Effector Cells
• A kriokonzerválás hatása az immunsejtek működésére
• Fagyasztott PBMC és immunsejt termékek

Antibody-dependent Cellular Cytotoxicity (ADCC)

Az antitest-függő celluláris citotoxicitás (ADCC) egy sejtközvetített immunvizsgálat, amelyet általában terápiás gyógyszerkutatásban használnak. Az ADCC mechanizmusa három lépésre osztható (1. ábra):

1. A célsejt felszínén lévő specifikus antigéneket az antitest felismeri és megköti.
2. Az immunsejt (effektorsejt) felismeri az antigénhez kötött antitestet, és ahhoz kötődik.
3. Az effektorsejt kiváltja a célsejt pusztulását.

.

1. ábra. Az ADCC mechanizmusa

A perifériás vérsejtekből tisztítható természetes ölősejteket (NK-sejtek) általában effektor sejtekként használják. A kriokonzervált NK-sejtek rugalmasabb, készenléti megoldást kínálnak az ADCC-teszteket végző kutatók számára.

Ebben a tanulmányban a kriokonzervált NK-sejtek ADCC-tesztekben való felhasználását vizsgáltuk luciferázt expresszáló A549-sejtek mint célsejtek felhasználásával. Egy humán anti-EGFR rekombináns antitestet használtunk az EGFR-hez való kötődéshez a célsejt felszínén és a sejthalál közvetítéséhez. A sejtpusztulást a célsejtek luciferáz-aktivitásának változásával határoztuk meg.

ADCC protokoll

A 2. ábra a kriokonzervált NK effektorsejtek felhasználásával végzett ADCC-teszt rövid munkafolyamatát mutatja. A teljes protokoll lépésről lépésre, beleértve a kriokonzervált sejtekkel történő vizsgálat elvégzéséhez szükséges tippeket és trükköket, az anyagokat és a vizsgálat optimalizálását, a ADCC protokoll kriokonzervált NK effektor sejtek felhasználásával.

.

2. ábra. ADCC protokoll

ADCC vizsgálatok kriokonzervált NK effektor sejtekkel

Kriokonzervált NK sejteket inkubáltunk luciferázt expresszáló A549 célsejtekkel E:T 6:1 és 18:1 arányban, növekvő koncentrációjú anti-EGFR antitest jelenlétében 24 órán keresztül. A kísérleteket két példányban végeztük (3. ábra). A kriokonzervált NK effektor sejtek 24 órás időintervallumot használva robusztus célsejtpusztítást mutattak az ADCC-tesztben (43,8%-os sejtpusztítás 6:1 E:T arány esetén és 76,6%-os sejtpusztítás 18:1 E:T arány esetén, ha az élő sejtek számát egy standard görbéből interpoláltuk). Az anti-EGFR antitest számított EC₅₀ értéke az ADCC-tesztben 1,5 ng/ml volt 6:1 E:T arány mellett és 2,5 ng/ml 18:1 E:T arány mellett.

3. ábra. ADCC-vizsgálat kriokonzervált NK-sejtek mint effektorsejtek, luciferáz riportergént expresszáló A549 sejtek mint célsejtek és növekvő koncentrációjú anti-EGFR antitest felhasználásával.

	E:T arány	Kiszámított eredmények
Célsejtpusztítás	6:1	43.8%
18:1	76.6%
EC50 (anti-EGFR antitest)	6:1	1.5 ng/ml
	18:1	2.5 ng/ml

A kriokonzervált NK effektor sejtek felhasználásával végzett vizsgálat reprodukálhatóságának meghatározásához az eredményeket három különböző kísérletben hasonlítottuk össze, amelyekhez minden egyes kísérlethez különböző, azonos donorból származó NK sejteket használtunk. Az adatok azt mutatták, hogy a vizsgálat reprodukálható volt, a sejtpusztítás hasonló százalékos aránya minden E:T aránynál és hasonló EC₅₀ értékek az anti-EGFR antitesthez az összes ADCC vizsgálatban (4. ábra).

4. ábra. Az ADCC-mérés reprodukálhatósága kriokonzervált NK effektorsejtek felhasználásával. Az anti-EGFR antitest esetében hasonló célsejt-ölési százalékokat és EC₅₀ értékeket figyeltünk meg minden E:T aránynál.

	E:T arány	Kísérlet A	Kísérlet B	Kísérlet C
Célsejtek megölése	6:1	43.8%	45,8%	50.6%
18:1	76.6%	61,7%	54.2%
EC50 (anti-EGFR antitest)	6:1	1.5 ng/ml	2.0 ng/mL	0.9 ng/ml
18:1	2.5 ng/ml	1.8 ng/mL	3,0 ng/mL

A donorok variabilitásának meghatározásához három különböző donorból származó, kriokonzervált NK-sejtek három tételét vizsgálták az ADCC-tesztben. Az összes donorból származó NK-sejtek >50%-os sejtölést mutattak 18:1 E:T arány mellett. A célsejtek elpusztításának hasonló százalékos aránya volt megfigyelhető minden E:T aránynál. Az anti-EGFR antitest számított EC₅₀ értékei hasonlóak voltak minden ADCC-teszt során (5. ábra).

5. ábra. Az ADCC-mérés reprodukálhatósága különböző donoroktól származó kriokonzervált NK-sejtek felhasználásával. E:T arány 6:1 (A) vagy E:T arány 18:1 (B).

E:T arány	Donor 1	Donor 2		Donor 3
Célsejtpusztítás	6:1	47.9%	43,1%	34.1%
18:1	57.8%	75,0%	55.0%
EC50 (anti-EGFR antitest)	6:1	1.1 ng/ml	3.9 ng/mL	5.3 ng/mL
	18:1	1.2 ng/ml	5.6 ng/mL	4,2 ng/mL

A kriokonzerválás hatása az immunsejtek működésére

A kriokonzervált PBMC-k és immunsejtek kényelmes, azonnal felhasználható alternatívát kínálnak a frissen izolált immunsejtekkel szemben. Megvizsgáltuk a kriokonzervált NK-sejtek teljesítményét ADCC-tesztekben. Bár az ADCC-teszt hosszabb inkubációs időt igényelt (24 óra), robusztus sejtölést és reprodukálható anti-EGFR antitest dózis-válasz eredményeket figyeltünk meg. A kriokonzervált NK-sejtek és PBMC-k gyakorlati alternatívát kínálnak a frissen izolált immunsejtekkel szemben a nagymértékben reprodukálható adatokhoz az antitest-függő sejtközvetített citotoxicitási vizsgálatokban.

Fagyasztott PBMC és immunsejt termékek

A Sigma-Aldrich^® örömmel kínálja a BioIVT PBMC és immunsejt altípusok széles választékát.

Normális emberi PBMC-k

Termék leírása	Termék mérete	Nem tipizált		Fagyasztott emberi normál PBMC	10 millió sejt injekciós üvegenként	HUMANPBMC-0001993	HUMANHLPB-0002560
		20 millió sejt injekciós üvegenként	HUMANPBMC-0002144	HUMANHLPB-0002572
50 millió sejt injekciós üvegenként	< HUMANPBMC-0002145	HUMANHLPB-0002056
100 millió sejt injekciós üvegenként	.HUMANPBMC-0002644	HUMANHLPB-0002561

Immunsejt altípusok

Termék leírása	Termék mérete	Nem tipizált		Fagyasztott emberi normál csontvelő mononukleáris sejtek (BMMC)	10 millió sejt fiolánként	HUMANBMMC-0002115	HUMANHLBM-0002228
20 millió sejt per fiola	HUMANBMMC-0002116	HUMANHLBM-0002229
50 millió sejt injekciós üvegenként	HUMANBMMC-0002117	HUMANHLBM-0002086/a>
Fagyasztott humán normál CD14+ monociták	10 millió sejt injekciós üvegenként	HUMANCD14-0002081	HUMANHL14-0002136
	20 millió sejt injekciós üvegenként	< HUMANCD14-0002080	HUMANHL14-0002135
40 millió sejt injekciós üvegenként	< HUMANCD14-0002079	HUMANCD14-0002079	HUMANHL14-0002059
Fagyasztott humán normál CD19+ B sejtek	10 millió sejt injekciós üvegenként	HUMANCD19-0002069<	HUMANHL19-0002057
Frozen Human Normal CD19+/IgD+ NaïB-sejtek	1 millió sejt injekciós üvegenként		HUMANHLIG-0002064
Fagyasztott humán normál CD3+ Pan T sejtek	10 millió sejt injekciós üvegenként	HUMANCD3-0002104<	HUMANHLT3-0002227
20 millió sejt per fiola	HUMANCD3-0002105	HUMANHLT3-0002072
Fagyasztott humán normál CD4+ Helper T-sejtek	10 millió sejt injekciós üvegenként	HUMANCD4-0002099	HUMANHLT4-0002226
	Fagyasztott humán normál CD4+/CD25+ szabályozó T-sejtek		2 millió sejt injekciós üvegenként	HUMANTREG-0002094	HUMANHLTR-0002225
Fagyasztott humán normál CD4+/CD45RA+/CD25- naiv T-sejtek	5 millió sejt fiolánként	HUMANNCD4-0002653		Minden más termékhez is tartozik.HUMANHL4RA-0043279
Fagyasztott humán normál CD4+/CD45RO+ memória T-sejtek
Fagyasztott humán normál CD4+/CD45RO+ memória T-sejtek	5 millió sejt injekciós üvegenként	HUMANMCD4-0002655	HUMANHL4RO-0002224
Fagyasztott humán normál CD8+ citotoxikus T-sejtek	10 millió sejt injekciós üvegenként	HUMANCD8-0002096	HUMANHLT8-0002627
Fagyasztott humán normál CD8+/CD45RA+ naiv citotoxikus T-sejtek	5 millió sejt fiolánként	HUMANNCD8-0002090	HUMANHL8RA-0002498</a>
Fagyasztott humán normál CD56+ NK sejtek, pozitívan szelektálva	5 millió sejt injekciós üvegenként	HUMANCD56-0002665	HUMANHL56-0002058
	Fagyasztott humán normál CD56+ NK sejtek, negatívan szelektált	5 millió sejt injekciós üvegenként	HUMANCD56-0002075	HUMANHL56-0002824
Fagyasztott humán normál CD34+ vérképző őssejtek	0.2 millió sejt fiolánként	HUMANCD34-0002046	< HUMANHL34-0002236
	1 millió sejt injekciós üvegenként	< HUMANCD34-0002042	HUMANHL34-0002232
5 millió sejt injekciós üvegenként	HUMANCD34-0002043	HUMANHL34-0002233
10 millió sejt injekciós üvegenként	HUMANCD34-0002044	HUMANHL34-0002234
20 millió sejt per fiola
20 millió sejt per injekciós üveg /p>	HUMANCD34-0002045	HUMANHL34-0002235