BL21 kémiailag kompetens sejtek áttekintése

Transzformáció előkészítése

ABL21 kémiailag kompetens sejtek transzformációja 40 μl-es reakciókban történik. A sejtek csomagolása csövenként 1, 2 vagy 4 reakcióhoz elegendő térfogatot tartalmaz.

A transzformáció 42 °C-on történő hősokkolással, majd jégen történő inkubálással történik.

A sikeres transzformációs eredmények biztosítása érdekében a következő óvintézkedéseket kell betartani:

• A használat előtt minden csövet alaposan elő kell hűteni jégen.
• A sejteket teljesen fel kell olvasztani jégen használat előtt.

A legmagasabb transzformációs hatékonyság érdekében a transzformáció után a mellékelt Expression Recovery Mediumot használja a sejtek reszuszpendálásához.

• A hősokkot egy 15 ml-es eldobható polipropilén tenyésztőcsőben (17 x 100 mm) végezze el. Más típusú csövek használata drámaian csökkentheti a transzformáció hatékonyságát.

Transzformációs protokoll

1. A szelekcióhoz készítsen tápanyag-agar (LB-Lennox vagy YT) lemezeket antibiotikummal. Vegye ki a Recovery Mediumot a fagyasztóból, és hozza szobahőmérsékletre.
2. Hűtse jégen a steril tenyésztőcsöveket (17 mm x 100 mm-es csövek, egy cső minden egyes transzformációs reakcióhoz).
3. Vegyük ki a sejteket a -80 °C-os fagyasztóból, és nedves jégen olvasztjuk fel teljesen (5-15 perc).
4. Adjunk 40 μL sejtet a hűtött tenyésztőcsőbe.
5. Adjunk 1 μL DNS-t a 40 μL sejthez. Röviden keverje meg egy pipettahegy segítségével; ne pipettázzon fel-le a keveréshez, mert ez légbuborékokat juttathat be és felmelegítheti a sejteket. A pUC19 kontrollhoz adjon 1 μL (10 pg) DNS-t egy másik tenyésztőcsőbe, amely 40 μL sejtet tartalmaz. Röviden keverje meg.
6. A sejt/DNS-keveréket 30 percig jégen inkubálja.
7. Hősokkolja a sejteket úgy, hogy a tenyésztőcsöveket 45 másodpercre 42 °C-os vízfürdőbe helyezi.
   
   A hősokk elvégzése abban az 1,7 mL-es csőben, amelyben a sejteket kapja, jelentősen csökkenti a transzformáció hatékonyságát.
   
   
8. Tegye vissza a csöveket 2 percre jégre.
9. Adjon 960 μL szobahőmérsékletű Expression Recovery Mediumot a tenyésztőcsőben lévő sejtekhez.
10. Tegye a csöveket rázó inkubátorba 250 rpm-en 1 órára 37 °C-on.
11. Tegyen legfeljebb 200 μL transzformációt LB-Lennox vagy YT agar lemezekre, amelyek a megfelelő antibiotikumot tartalmazzák. A DNS-től függően a lemezképzési mennyiséget optimalizálni kell.
    A pUC19 kontrollhoz a transzformációból 200 μL-t lemezeljünk LB-Lennox vagy YT agar lemezekre, amelyek 100 μg/mL karbenicillint vagy ampicillint tartalmaznak.
12. Inkubáljuk a lemezeket egy éjszakán át 37 °C-on.
13. A transzformált klónok tovább tenyészthetők LB vagy bármely más laktózmentes táptalajon.
    

Mintaindukciós protokoll

1. Inokuláljon egyetlen kolóniát egy frissen csíkozott lemezről 5 ml LB táptalajba, amely a plazmidnak és a gazdatörzsnek megfelelő antibiotikumot tartalmazza.
2. 37 °C-on rázva inkubálja egy éjszakán át. Az indukciót megelőzően a célfehérje expressziójának minimalizálása érdekében adjunk glükózt a táptalajhoz 0,2%-os (w/v) végső koncentrációig.
3. Inokuláljunk 50 mL megfelelő antibiotikumot tartalmazó LB táptalajt 0.5 mL-t a 2. lépésben elkészített éjszakai tenyészetből.
4. 37 °C-on rázással inkubáljuk, amíg az OD600 el nem éri a 0,6-0,8 értéket.
5. Adjunk hozzá IPTG-t 1 mM végső koncentrációig. A célfehérje maximális expressziójához szükséges optimális IPTG-koncentráció meghatározásához tesztelje a 0,25 - 2 mM közötti IPTG-koncentráció tartományt.
6. Inkubáljon 37 °C-on 3-4 órán keresztül. A célfehérje indukciójának optimális ideje 2-16 óra között változhat.
7. Tegyük a kultúrát 10 percre jégre. Szedje ki a sejteket 5 000 x g-nél 10 percig tartó centrifugálással 4 °C-on.
8. Vegye ki a felülúszót, és tárolja a sejtpelletet -20 °C-on (alacsonyabb hőmérsékleten történő tárolás is elfogadható).

.