In Vitro humán PBMC-ból származó monociták differenciálódása M1 vagy M2 makrofágokká szérum- és xeno-mentes sejtkultúrás közegben.

A makrofágok szöveti rezidens professzionális fagociták és antigénprezentáló sejtek (APC), amelyek a keringő perifériás vér monocitáiból differenciálódnak. Fontos aktív és szabályozó funkciókat töltenek be a veleszületett és az adaptív immunitásban.¹ A különböző fenotípusú aktivált makrofágokat rutinszerűen M1 makrofágok (CAM) vagy M2 makrofágok (AAM) csoportjába sorolják. A klasszikusan aktivált M1 makrofágok akut gyulladásos fenotípusú immunhatású effektorsejteket foglalnak magukban. Ezek rendkívül agresszívek a baktériumokkal szemben, és nagy mennyiségű limfokint termelnek.² Az alternatív módon aktivált, gyulladáscsökkentő M2 makrofágok legalább három alcsoportra különíthetők el. Ezek az altípusok különböző funkciókkal rendelkeznek, többek között az immunitás szabályozásával, a tolerancia fenntartásával és a szöveti javítással/sebgyógyulással.^1,2 A makrofág vonalhoz tartozó sejtek valóban rendkívüli plaszticitást mutatnak endogén és exogén ingerekre adott válaszként, ami lehetővé teszi a kezdeti M1/M2 polarizációs folyamatok² átalakulását, például az M2-polarizált makrofágok bizonyos körülmények között M1-aktivált állapotba is át tudnak alakulni.

A primer humán makrofágokat nehéz megfelelő mennyiségben izolálni a szövetekből, és tenyészetben nem szaporodnak. Emellett általánosan elfogadott, hogy a nyert sejtek gyakran jelentős fenotípusos heterogenitást mutatnak. A monocitákból származó makrofágok kiváló alternatívát jelentenek, mivel a humán vérből származó monociták könnyen és nagy számban rendelkezésre állnak, és in vitro makrofágokká differenciálhatók. A PromoCell makrofág generáló médiumokat nagy tisztaságú M1 vagy M2 makrofágok hatékony differenciálására tervezték közvetlenül PBMC-kből, mint kiindulási anyagból. A DXF makrofág-generáló médiumok szérummentesek/xeno-mentesek, és ellenőrzött tenyésztési környezetet biztosítanak, amely mentes minden állati komponensből származó stimulustól - ez jelentős előny a magasan reaktív immunsejteket képviselő monociták és makrofágok szempontjából. Ennek eredményeképpen ezekből a táptalajokból hiányoznak az FBS-nek tulajdonítható nemkívánatos, nem definiált és káros hatások, és ezért lehetővé teszik a makrofágok standardizált és ellenőrzött differenciálódását. In vitro a monociták differenciálása a PromoCell M1-makrofág generáló médium DXF (C-28055) jelenlétében., GM-CSF-et tartalmaz) M1-szerű polarizált CD68+/ CD80+/CD163- makrofágokat mutató makrofágokhoz vezet, míg az M2-Makrofággeneráló médium DXF (C-28056, M-CSF-et tartalmaz) M2-szerű polarizált CD68+/CD80-/CD163+ makrofágokat segít elő. A Macrophage Base Medium DXF (C-28057) a felhasználó által testre szabható, citokinek nélküli változatot képviseli, ezért a felhasználónak megfelelő kiegészítést kell végeznie. Szükség esetén az M1/ M2-polarizált makrofágok személyre szabott aktiválása és altípus-specifikus polarizációja a felhasználó által elvégezhető.

1. ábra. A PromoCell M1/M2 makrofág generáló médium DXF használatával készült protokoll áttekintése.

Makrofág differenciálási protokoll

1. Mononukleáris sejtek izolálása (0. nap). Friss PBMC-ket izoláljon a buffy coatsból a rutin protokoll segítségével.
2. Mononukleáris sejtek elemzése (0. nap). Számolja meg és elemezze az izolált PBMC-ket monocita-tartalom szempontjából (pl. egy áramlási citométer FSC/SSC-diagramjának segítségével). Ezt követően reszuszpendálja a sejteket 100X10⁶ PBMCs/ml mennyiségben monocita csatolási médiumban (C-28051).
3. Hagyja a monocitákat rögzülni (0. nap). Tegyük a frissen izolált PBMC-ket megfelelő mennyiségű Monocyta Attachment Mediumba (C-28051), pl. 15 ml Medium T-75 lombikonként. Használjon 1 millió/cm²2 -es vetési sűrűséget ≥25%-os monocita-tartalmú mononukleáris sejtek esetén és 1,5 millió/cm²2 -es vetési sűrűséget <25%-os monocita-tartalom esetén. Inkubáljuk 1-1,5 órán át 5% CO₂ -on és 37 °C-on az inkubátorban minden további manipuláció nélkül.
4. Készítsük el a teljes DXF makrofág generáló médiumot (0. nap). Készítse el a Makrofág-generáló médium DXF-et (C-28055, C-28056) a felolvasztott Kiegészítő keverék aszeptikus hozzáadásával a bázikus médiumhoz. Óvatosan keverje össze, hogy homogén keveréket kapjon. Ezután adjuk hozzá az M1 vagy M2 citokinkeveréket.
5. Mossuk le az adherens sejtfrakciót (0. nap). A szövettenyésztő edény erőteljes kavargatásával lazítsuk meg a nem adherens sejteket és szívjuk le őket. Az adherens sejteket, azaz a monocitákat háromszor mossuk át meleg Monocyta Attachment Mediummal (C-28051) az edényt kavargatva és a felülúszót leszívva.
6. Elkezdjük a makrofág differenciálódást (0. nap). Adjunk a sejtekhez megfelelő mennyiségű teljes M1- vagy M2-makrofág generáló médium DXF-et (C-28055, C-28056), e.pl. 20 ml-t T-75 lombikonként, és inkubáljuk 6 napig 37 °C-on és 5% CO₂ -on, tápfolyadékcsere nélkül.
7. Folytassuk a differenciálódási folyamatot (6. nap). Adjunk a sejtekhez további 50-75 térfogatszázaléknyi friss teljes M1- vagy M2- makrofág generáló médium DXF-et (C-28055, C-28056). Az éretlen makrofágokat további 3 napig inkubáljuk 37 °C-on és 5% CO₂ mellett.
8. Választható lépés: makrofág-aktiválás (7. nap). A specifikus makrofág-aktiváláshoz a tenyészet teljes térfogatát kiegészítjük az ügyfél által választott megfelelő ingerekkel. Ne végezzen médiumcserét, csak adja hozzá az aktiváló faktorokat. Példák a makrofágok meghatározott stimulusokkal történő aktiválására: Klasszikusan aktivált M1 makrofágok hozhatók létre az IFN-γ (50 ng/ml) és LPS (10 ng/ml) M1 makrofágokhoz történő hozzáadásával. Az M2 makrofágok M2a-aktiválása 20 ng/ml IL-4 segítségével érhető el. Immunkomplexekkel és IL-1β vagy LPS -vel való kiegészítés M2b-aktivációt vált ki, míg IL-10, TGFβ vagy glükokortikoidok az M2-makrofágok M2c-aktivációjához vezetnek. Az M1 aktivált makrofágok alternatív típusát az M2 makrofágok IFN-γ és LPS [2] aktiválásával lehet elérni.
9. Médiumcsere (9. nap). A szuszpenziós sejteket tartalmazó médiumot szívjuk le, és gyűjtsük össze centrifugálócsőbe. Azonnal pipettázzon friss, teljes PromoCell makrofág generáló médiumot DXF (C-28055, C-28056), megfelelő citokinekkel/aktiváló faktorokkal kiegészítve a sejtekhez. Centrifugálja a sejteket a csőben 15 percig 350 x g-n szobahőmérsékleten. Dobja el a felülúszót, és óvatosan szuszpendálja újra a sejteket kis mennyiségű friss tápfolyadékban. Egyesítse a csőben lévő reszuszpendált sejteket a szövettenyésztő edényben lévő friss tápfolyadékban lévő tapadó sejtekkel. Inkubáljuk másnapig 37 °C-on és 5% CO₂-on.
10. A makrofágok készen állnak (10. nap). A makrofágok most már közvetlenül felhasználhatók azokon a lemezeken, ahol tartózkodnak, pl. fagocitózisvizsgálatok elvégzésekor. A tenyészet fenntartása akár három hétig is lehetséges a heti médiumcserék elvégzésével, friss, teljes makrofággeneráló médium DXF (C-28055, C-28056) friss médiummal. 

Eredmények

2. ábra. A humán PBMC-ből származó M1 makrofágok morfológiája és fagocitáló aktivitása. A) Fázisfényes képek M1 makrofágokról 24 órával a PromoCell makrofág generáló médiumában történő kiültetés után. B) A PromoCell kriokonzervált M1 makrofágok nagyszámú fluoreszcensen jelölt E.coli. baktériumot nyelnek el.

3. ábra. A humán PBMC-ből származó M2 makrofágok morfológiája és fagocitikus aktivitása. A) Fázisfényes képek M2 makrofágokról 24 órával a PromoCell makrofág generáló médiumában történő kiültetés után. B) A PromoCell kriokonzervált M2 makrofágok nagyszámú fluoreszcensen jelölt E.coli. baktériumot nyelnek el.

4. ábra. A PromoCell Macrophage Generation Medium DXF-ben létrehozott 10. napi M1 és M2 makrofágok áramlási citometriás elemzése. A friss perifériás vér mononukleáris sejteket (PBMC-k) a Monocyta Attachment Mediumba ültették. A megtisztított monocitákat 10 napig differenciáltuk a választható aktiválási lépés elvégzése nélkül. Az M1 makrofágok CD68+ (99% pozitív) és CD80+ (83% pozitív) markerprofilt mutatnak, míg az M2 makrofágok CD68+ (99% pozitív) és CD163+ (95% pozitív) markerprofilt mutatnak.

Hivatkozások

1. Murray PJ, Wynn TA. 2011. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11(11):723-737. https://doi.org/10.1038/nri3073

2. Murray PJ, Wynn TA. 2011. Obstacles and opportunities for understanding macrophage polarization. Journal of Leukocyte Biology. 89(4):557-563. https://doi.org/10.1189/jlb.0710409

3. Gordon S. 2003. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 3(1):23-35.

4. Khramtsova G, Liao C, Khramtsov A, Li S, Gong C, Huo D, Nanda R. 2009. The M2/Alternatively Activated Macrophage Phenotype Correlates with Aggressive Histopathologic Features and Poor Clinical Outcome in Early Stage Breast Cancer.. https://doi.org/10.1158/0008-5472.sabcs-09-107

5. Menzies FM, Henriquez FL, Alexander J, Roberts CW. Sequential expression of macrophage anti-microbial/inflammatory and wound healing markers following innate, alternative and classical activation. 160(3):369-379. https://doi.org/10.1111/j.1365-2249.2009.04086.x