Ugrás a tartalomra
Merck
KezdőlapApplicationsProtein BiologyFehérje Pull-Down technikák

Fehérje Pull-Down technikák

A pull-down assay két vagy több fehérje kölcsönhatásának meghatározására szolgál. Az affinitási pull-down próbák során egy ″bait″ fehérjét megjelölnek és rögzítenek egy immobilizált ligandumon (hordozógyöngyök) kovalens kötéssel vagy affinitási címkén keresztül, például immobilizált fémaffinitás-kromatográfiával (IMAC). A gyakori csalifehérje-fúziós címkék közé tartoznak a glutation-S-transzferáz (GST) és a hisztidin-jelölésű fehérjék. A csalifehérje komplexet képez, amelyet aztán egy fehérjeforrással, például sejt- vagy szövetlizátummal inkubálnak. Az érdeklődésre számot tartó fehérjéket a gyöngyös hordozóról több mosáson keresztül eluáljuk, majd centrifugálással összegyűjtjük. Az affinitásos pull-down tisztítási és kimutatási módszer abban különbözik az immunprecipitációs (IP) és a Co-IP vizsgálatoktól, hogy nem antitest-antigén kölcsönhatásról van szó. Minden pull-down vizsgálatnál a megtisztított mintát gyakran SDS-PAGE, tömegspektrális elemzéssel és Western blot detektálással elemzik a további downstream analízishez.

Kapcsolódó műszaki cikkek

Kapcsolódó protokollok

További cikkek és protokollok keresése

Affinitás Pull-Down Assay

Affinity GST Pull-Down Applications

A glutation S-transzferáz (GST) egy 211 aminosavból álló fehérje, amely a legtöbb szervezetben megtalálható. A GST-t gyakran integrálják expressziós vektorokba, hogy a E. coli fehérje-expressziós rendszereken belül fúziós taget állítsanak elő. A GST-tag egy nagyméretű, körülbelül 26 kDa fehérje, és kifejezhető baktériumokban, élesztő-, emlős- és rovarsejtekben. A GST-tag előnyös, ha a rekombináns fehérje védelmére van szükség az intracelluláris proteázok hasításával szemben, és ha a jelölt fehérje oldhatóságát növelni kell. Ezenkívül a GST-fehérje nagy affinitású taget biztosít az egyszerű tisztításhoz és az olcsó affinitásgyantákat használó, enyhe elúciós körülmények között végzett pull-down-kísérletekhez.

Co-immunoprecipitáció

A pull-down vizsgálat ideális a co-immunoprecipitációs eredmények ellenőrzésére, és kiváló módszer ismeretlen fehérje-fehérje kölcsönhatások azonosítására, valamint specifikus fehérjék aktivációs állapotának meghatározására. Az affinitási pull-down módszerekkel ellentétben az IP antitesteket használ az antigének komplex biológiai mintákhoz való kötődésére és izolálására. 

A ko-IP egy antitest használatára utal, amely egy antigént köt meg egy multiprotein komplexen belül. A komplexet ezután protein A vagy protein G közeg hozzáadásával rögzítjük. A fehérje A/G nagy affinitása a poliklonális és monoklonális IgG típusú antitestek Fc régiójához kritikus komponenssé teszi őket az érdeklődésre számot tartó fehérje vagy fehérjekomplex tisztításában. A fehérje pull-down módszerek alkalmazása alapvető eszköz a fehérje-fehérje kölcsönhatási hálózatok vizsgálatához; a konkrét módszer kiválasztását azonban a kutató konkrét alkalmazási igénye határozza meg.

Kapcsolódó alkalmazások
Fehérje tömegspektrometria
A fehérjék tömegspektrometriás technikáinak áttekintése, amelyeket a fehérjék azonosítására és mennyiségi meghatározására, poszttranszlációs módosításokra, glikánprofilok készítésére és fehérje-fehérje kölcsönhatásokra használnak a gyógyszerkutatásban és a proteomikai kutatásban.
Gélelektroforézis
A fehérje gélelektroforézist fehérjék elválasztására használják tisztítás, jellemzés és kimutatás céljából. Az olyan módszereket, mint a natív PAGE, az SDS-PAGE, a 2D PAGE és az izoelektromos fókuszálás (IEF), a későbbi alkalmazások, például a Western blotting, a tömegspektrometria és a proteomikai elemzés előkészítésére használják.
Western Blotting
A fehérjék kimutatására szolgáló Western blotting elveinek és alkalmazásainak áttekintése. Részletes protokollok, videók és egyéb források linkjeit tartalmazza a fehérjeextrakció, a gélelektroforézis, a PVDF- vagy nitrocellulózmembránra történő átvitel, valamint a kemilumineszcens, kolorimetrikus és fluoreszcens kimutatási módszerekhez.
(ELISA) Enzimhez kötött immunszorbiens próba
Az enzimhez kötött immunoszorbens tesztek (ELISA) tartalmaznak közvetlen, közvetett és befogási (szendvics) kimutatási formákat egy specifikus antigén azonosítására és mennyiségi meghatározására.
Fehérjekoncentráció és puffercsere
A fehérjeminták koncentrálására és tisztítására használt technikák áttekintése a tisztítási, biofeldolgozási és elemzési munkafolyamatokhoz. Tartalmazza a szűrési és ultraszűrési technikák, a fehérjedúsítás, valamint a dialízis, diafiltráció és kromatográfiás módszerek segítségével történő sótalanítás és puffercsere protokolljait és videóit.
Enzimaktivitási vizsgálatok
Enzimaktivitás-vizsgálati reagensek és protokollok egy enzim specifikus aktivitásának vizsgálatára egy szervezetben, szövetben vagy mintában.
Fehérjék jelölése és módosítása
Fehérjemegjelölési alkalmazások enzim-fehérje jelölés, fluoreszcens fehérje jelölés és célzott fehérje lebontási technológiák alkalmazásával.
Fehérje expresszió
Fehérje-expressziós technológiák különböző expressziós rendszerekhez, amelyek támogatják a kutatást, a terápiás szereket és a vakcinagyártást.
A folytatáshoz jelentkezzen be

Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.

Még nem rendelkezik fiókkal?