Centrifugálás alapjai
A természetes gravitációs erők és a centrifugálás
A Föld gravitációs ereje elegendő ahhoz, hogy sokféle részecske idővel szétváljon. Egy cső antikoagulált teljes vér, amelyet egy padon hagyunk állni, végül plazmára, vörösvértestekre és fehérvérsejt-frakciókra válik szét. A szükséges idő hossza azonban a legtöbb alkalmazásnál kizárja ezt az elválasztási módot.
A gyakorlatban a legtöbb részecske elválasztásához centrifugális erőre van szükség. Ezenkívül a biológiai vegyületek hosszabb tárolás során bekövetkező esetleges lebomlása miatt gyorsabb elválasztási technikákra van szükség.
A centrifugálás az egyik legalapvetőbb laboratóriumi alkalmazás, amelyet a klinikai és kutatói személyzet széles köre használ. A centrifugálás lényegében a részecskék üledékképződéssel történő elválasztása. Bár a centrifugálással történő szedimentáció nem új technológia, az élvonalbeli genomikai és proteomikai kutatásokhoz nélkülözhetetlen, mivel tisztított, érdekes részecskéket biztosít.
A részecskék szuszpenziójában a gravitációs erő segítségével történő elválasztás sebessége elsősorban a részecskék méretétől és sűrűségétől függ. A nagyobb sűrűségű vagy nagyobb méretű részecskék jellemzően gyorsabban haladnak, és egy bizonyos ponton elválnak a kisebb sűrűségű vagy kisebb méretű részecskéktől. A részecskéknek, köztük a sejteknek ez az ülepedése a Stoke-törvénnyel magyarázható, amely egy gömb gravitációs térben való mozgását írja le.1 Az egyenlet öt paraméter felhasználásával számítja ki az ülepedés sebességét (1. ábra).
1. ábra.A Stoke-törvény egyenlete.
Részecskék viselkedése és szétválasztása
A Stokes-egyenletből a részecskék öt fontos viselkedése magyarázható:
- A részecskék ülepedési sebessége arányos a részecskemérettel.
- A szedimentációs sebesség arányos a részecske és a közeg sűrűségkülönbségével.
- A szedimentációs sebesség nulla, ha a részecskék sűrűsége megegyezik a közeg sűrűségével.
- A szedimentációs sebesség csökken, ha a közeg viszkozitása nő.
- A szedimentációs sebesség nő, ha a gravitációs erő nő.
Relatív centrifugális erő
A legtöbb részecske olyan kicsi, hogy a gravitációs erő nem elegendő a részecskék véletlenszerű molekuláris erőinek legyőzéséhez, hogy befolyásolja az elválást. A centrifugálás - így nevezik azokat az elválasztási alkalmazásokat, amelyeknél egy tengely körüli forgás révén centrifugális erő keletkezik - a gravitációs mező nagyságának növelésére szolgál. A szuszpenzióban lévő részecskék radiális centrifugális erő hatására a forgástengelytől távolodnak.2
A forgó rotor által keltett radiális erőt a földi gravitációs erőhöz viszonyítva fejezik ki, ezért relatív centrifugális erőnek (RCF) vagy "g erőnek nevezik." A részecskékre ható g-erő a forgási sebességgel (percenkénti fordulatszámban (rpm) kifejezve) exponenciálisan függ.
A forgási sebesség megduplázása négyszeresére növeli a centrifugális erőt. A centrifugális erő a forgástengelytől való távolsággal is nő. E két paraméter jelentős jelentőséggel bír a megfelelő centrifuga kiválasztásakor. Az 1. táblázat összefoglalja a relatív centrifugális erő alapján osztályozható alkalmazásokat.3
* Meg lehet csinálni, de általában nem használják erre a célra.
AzRCF függ a fordulatszámtól fordulatszámban kifejezve és a részecskéknek a forgásközépponttól való távolságától. Ha a forgási sebességet fordulatszámban (Q) adjuk meg, a távolságot (r) pedig centiméterben fejezzük ki, az RCF kiszámítható a 2. ábra.
képlet segítségével.2. ábra.A relatív centrifugális erő (RCF) képlete.
Kis sebességű centrifugálás nomogramja
A nomogram arra is használható, hogy megkapjuk a kívánt RCF-hez szükséges centrifuga rotor sebességét (3. ábra). Ez a gyors becslés hasznos alacsony fordulatszámú centrifugálási alkalmazásoknál. A 10 000 fordulat/perc feletti sebességeknél azonban pontosabb az RCF-számítás használata.
3. ábra.Nomogram a centrifuga fordulatszám-beállítás becsléséhez.
Nomogram utasítások
- Mérje meg a sugarat (cm) a centrifuga rotor közepétől a kémcsőhordozó végéig.
- Meghatározza az alkalmazáshoz szükséges relatív centrifugális erőt.
- A sugár értékét a relatív centrifugális erő (g) értékével összekötő egyenes segítségével a jobb oldali oszlopból leolvasható a rotor fordulatszáma (rpm).
Sűrűséggradiens centrifugálás<./span>
A sűrűséggradiens centrifugálás olyan technika, amely lehetővé teszi a részecskék elválasztását méretük, alakjuk és sűrűségük alapján. A sűrűséggradienst jellemzően úgy hozzák létre, hogy növekvő sűrűségű közegeket rétegeznek egy centrifugacsőben. Amikor a mintát sűrűséggradiensre rétegezzük és centrifugáljuk, a különböző részecskék különböző sebességgel mozognak a gradiensben. A részecskék sávok vagy zónák formájában jelennek meg a gradiensben, a sűrűbb és nagyobb részecskék vándorolnak a legtovább.
Sűrűséggradiens közegek
Sűrűséggradiens közegként számos különböző vegyületet vizsgáltak. Az egyik első sűrűséggradiens centrifugálási technikát az 1950-es években fejlesztették ki, és pufferelt szacharózoldatot használt a sejtorganellumok tisztítására. A szacharóz hamarosan a homogenizált emlősszövetek elválasztására használt sűrűségfokozó közeggé vált. Később cézium-klorid gradienseket használtak a különböző sűrűségű DNS elválasztására. Meselson és Stahl 1958-ban cézium-klorid sűrűséggradiens centrifugálást használt egy elegáns kísérletben a DNS-replikáció félkonzervatív modelljének alátámasztására. A kolloid-szilícium-dioxid szuszpenziókat először a DuPont gyártotta, és LUDOX® néven értékesítették.4
1977-ben vált elérhetővé a Percoll® nevű, polivinilpirrolidonnal (PVP) bevont stabilizált szilícium-dioxid-kolloid, amely sejtek és szubcelluláris részecskék elválasztására szolgál. 1968-ban Boyum leírta a mononukleáris sejtek keringő vérből és csontvelőből történő izolálásának módszereit poliszacharid és sugárzást gátló kontrasztanyag keverékeinek felhasználásával. Ez vezetett az 1970-es években az első nem ionos jódozott sűrűséggradiens közeg, a metrizamid kifejlesztéséhez.5 Ma már a kereskedelmi forgalomban kapható jódozott sűrűséggradiens közegek széles választéka áll rendelkezésre.
Hivatkozások
Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.
Még nem rendelkezik fiókkal?