Ugrás a tartalomra
Merck

Centrifugálás alapjai

A természetes gravitációs erők és a centrifugálás

A Föld gravitációs ereje elegendő ahhoz, hogy sokféle részecske idővel szétváljon. Egy cső antikoagulált teljes vér, amelyet egy padon hagyunk állni, végül plazmára, vörösvértestekre és fehérvérsejt-frakciókra válik szét. A szükséges idő hossza azonban a legtöbb alkalmazásnál kizárja ezt az elválasztási módot. 

A gyakorlatban a legtöbb részecske elválasztásához centrifugális erőre van szükség. Ezenkívül a biológiai vegyületek hosszabb tárolás során bekövetkező esetleges lebomlása miatt gyorsabb elválasztási technikákra van szükség.

A centrifugálás az egyik legalapvetőbb laboratóriumi alkalmazás, amelyet a klinikai és kutatói személyzet széles köre használ. A centrifugálás lényegében a részecskék üledékképződéssel történő elválasztása. Bár a centrifugálással történő szedimentáció nem új technológia, az élvonalbeli genomikai és proteomikai kutatásokhoz nélkülözhetetlen, mivel tisztított, érdekes részecskéket biztosít.

A részecskék szuszpenziójában a gravitációs erő segítségével történő elválasztás sebessége elsősorban a részecskék méretétől és sűrűségétől függ. A nagyobb sűrűségű vagy nagyobb méretű részecskék jellemzően gyorsabban haladnak, és egy bizonyos ponton elválnak a kisebb sűrűségű vagy kisebb méretű részecskéktől. A részecskéknek, köztük a sejteknek ez az ülepedése a Stoke-törvénnyel magyarázható, amely egy gömb gravitációs térben való mozgását írja le.1 Az egyenlet öt paraméter felhasználásával számítja ki az ülepedés sebességét (1. ábra).

Egy matematikai egyenlet, amely a Stoke-törvény kiszámításának képletét mutatja: "v = d^2 (p-L) x g/18n".

1. ábra.A Stoke-törvény egyenlete.

Részecskék viselkedése és szétválasztása

A Stokes-egyenletből a részecskék öt fontos viselkedése magyarázható:

  1. A részecskék ülepedési sebessége arányos a részecskemérettel.
  2. A szedimentációs sebesség arányos a részecske és a közeg sűrűségkülönbségével.
  3. A szedimentációs sebesség nulla, ha a részecskék sűrűsége megegyezik a közeg sűrűségével.
  4. A szedimentációs sebesség csökken, ha a közeg viszkozitása nő.
  5. A szedimentációs sebesség nő, ha a gravitációs erő nő.

Relatív centrifugális erő

A legtöbb részecske olyan kicsi, hogy a gravitációs erő nem elegendő a részecskék véletlenszerű molekuláris erőinek legyőzéséhez, hogy befolyásolja az elválást. A centrifugálás - így nevezik azokat az elválasztási alkalmazásokat, amelyeknél egy tengely körüli forgás révén centrifugális erő keletkezik - a gravitációs mező nagyságának növelésére szolgál. A szuszpenzióban lévő részecskék radiális centrifugális erő hatására a forgástengelytől távolodnak.2

A forgó rotor által keltett radiális erőt a földi gravitációs erőhöz viszonyítva fejezik ki, ezért relatív centrifugális erőnek (RCF) vagy "g erőnek nevezik." A részecskékre ható g-erő a forgási sebességgel (percenkénti fordulatszámban (rpm) kifejezve) exponenciálisan függ.

A forgási sebesség megduplázása négyszeresére növeli a centrifugális erőt. A centrifugális erő a forgástengelytől való távolsággal is nő. E két paraméter jelentős jelentőséggel bír a megfelelő centrifuga kiválasztásakor. Az 1. táblázat összefoglalja a relatív centrifugális erő alapján osztályozható alkalmazásokat.3

1. táblázat.A centrifugák osztályai és alkalmazásuk.

* Meg lehet csinálni, de általában nem használják erre a célra.

AzRCF függ a fordulatszámtól fordulatszámban kifejezve és a részecskéknek a forgásközépponttól való távolságától. Ha a forgási sebességet fordulatszámban (Q) adjuk meg, a távolságot (r) pedig centiméterben fejezzük ki, az RCF kiszámítható a 2. ábra.

képlet segítségével.
Egy matematikai egyenlet, amely az RCF (relatív centrifugális erő) kiszámításának képletét mutatja: "RCF = 11,18 x r x (Q/1000)^2".

2. ábra.A relatív centrifugális erő (RCF) képlete.

Kis sebességű centrifugálás nomogramja

A nomogram arra is használható, hogy megkapjuk a kívánt RCF-hez szükséges centrifuga rotor sebességét (3. ábra). Ez a gyors becslés hasznos alacsony fordulatszámú centrifugálási alkalmazásoknál. A 10 000 fordulat/perc feletti sebességeknél azonban pontosabb az RCF-számítás használata.

Többtengelyes grafikon, amely a cm-ben kifejezett sugár, a g erő és a fordulatszám közötti kapcsolatot mutatja. Az A tengelyen a "Radius (cm)" felirat szerepel, 3 és 30 cm közötti értékekkel. A B tengely a "g-erőt" jelöli 10 és 7000 g között. A C tengely a "fordulatszámot" mutatja 500 és 5000 fordulat/perc közötti értékekkel. A grafikon a sugár, a g erő és a fordulatszám átváltására szolgál.

3. ábra.Nomogram a centrifuga fordulatszám-beállítás becsléséhez.

Nomogram utasítások

  1. Mérje meg a sugarat (cm) a centrifuga rotor közepétől a kémcsőhordozó végéig.
  2. Meghatározza az alkalmazáshoz szükséges relatív centrifugális erőt.
  3. A sugár értékét a relatív centrifugális erő (g) értékével összekötő egyenes segítségével a jobb oldali oszlopból leolvasható a rotor fordulatszáma (rpm).

Sűrűséggradiens centrifugálás<./span>

A sűrűséggradiens centrifugálás olyan technika, amely lehetővé teszi a részecskék elválasztását méretük, alakjuk és sűrűségük alapján. A sűrűséggradienst jellemzően úgy hozzák létre, hogy növekvő sűrűségű közegeket rétegeznek egy centrifugacsőben. Amikor a mintát sűrűséggradiensre rétegezzük és centrifugáljuk, a különböző részecskék különböző sebességgel mozognak a gradiensben. A részecskék sávok vagy zónák formájában jelennek meg a gradiensben, a sűrűbb és nagyobb részecskék vándorolnak a legtovább.

Sűrűséggradiens közegek

Sűrűséggradiens közegként számos különböző vegyületet vizsgáltak. Az egyik első sűrűséggradiens centrifugálási technikát az 1950-es években fejlesztették ki, és pufferelt szacharózoldatot használt a sejtorganellumok tisztítására. A szacharóz hamarosan a homogenizált emlősszövetek elválasztására használt sűrűségfokozó közeggé vált. Később cézium-klorid gradienseket használtak a különböző sűrűségű DNS elválasztására. Meselson és Stahl 1958-ban cézium-klorid sűrűséggradiens centrifugálást használt egy elegáns kísérletben a DNS-replikáció félkonzervatív modelljének alátámasztására. A kolloid-szilícium-dioxid szuszpenziókat először a DuPont gyártotta, és LUDOX® néven értékesítették.4

1977-ben vált elérhetővé a Percoll® nevű, polivinilpirrolidonnal (PVP) bevont stabilizált szilícium-dioxid-kolloid, amely sejtek és szubcelluláris részecskék elválasztására szolgál. 1968-ban Boyum leírta a mononukleáris sejtek keringő vérből és csontvelőből történő izolálásának módszereit poliszacharid és sugárzást gátló kontrasztanyag keverékeinek felhasználásával. Ez vezetett az 1970-es években az első nem ionos jódozott sűrűséggradiens közeg, a metrizamid kifejlesztéséhez.5 Ma már a kereskedelmi forgalomban kapható jódozott sűrűséggradiens közegek széles választéka áll rendelkezésre.

Kapcsolódó termékek
Loading

Hivatkozások

1.
Sharpe PT. 2012. Methods of Cell Separation. Elsevier Science.
2.
Graham J. 2001. Biological Centrifugation. 1. Garland Science.
3.
Rickwood D, Ford T, Steensgaard J. 1994. Centrifugation: Essential Data. Wiley.
4.
Rickwood D. 1984. Centrifugation: A Practical Approach. 2. Oxford University Press.
5.
Rickwood D. 1983. Iodinated Density Gradient Media, A Practical Approach. Oxford University Press.
A folytatáshoz jelentkezzen be

Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.

Még nem rendelkezik fiókkal?